عزل الخمائر والعفن القابل للزراعة عن التربة للتحقيق في التركيب السكاني الفطري
Summary
هذا البروتوكول هو وسيلة فعالة وسريعة لزراعة الخمائر والعفن Aspergillus fumigatus من مجموعات كبيرة من عينات التربة في أقل من 7 أيام. يمكن تعديل الطرق بسهولة لاستيعاب مجموعة من وسائط الحضانة ودرجات الحرارة حسب الحاجة للتجارب.
Abstract
تستضيف التربة كمية لا تصدق من الحياة الميكروبية ، حيث يحتوي كل غرام على ما يصل إلى مليارات الخلايا البكتيرية والقديمة والفطرية. تؤدي الفطريات متعددة الخلايا مثل القوالب والفطريات أحادية الخلية ، التي تعرف على نطاق واسع بأنها خمائر ، أدوارا أساسية في النظم الإيكولوجية للتربة كمحللة للمواد العضوية وكمصادر غذائية لسكان التربة الآخرين. يعتمد تنوع الأنواع الفطرية في التربة على العديد من العوامل المناخية مثل هطول الأمطار ودرجة الحرارة ، بالإضافة إلى خصائص التربة بما في ذلك المواد العضوية ودرجة الحموضة والرطوبة. إن الافتقار إلى العينات البيئية الكافية، وخاصة في مناطق آسيا وأفريقيا وأمريكا الجنوبية وأمريكا الوسطى، يعوق توصيف المجتمعات الفطرية في التربة واكتشاف أنواع جديدة.
قمنا بتمييز المجتمعات الفطرية في التربة في تسعة بلدان عبر القارات الست باستخدام حوالي 4000 عينة من التربة وبروتوكول تم تطويره في المختبر لعزل الخمائر والعفن. يبدأ هذا البروتوكول بالتخصيب الانتقائي المنفصل للخمائر والعفن ذي الصلة طبيا Aspergillus fumigatus ، في الوسائط السائلة مع تثبيط نمو البكتيريا. ثم يتم نقل المستعمرات الناتجة إلى وسائط صلبة ومعالجتها للحصول على ثقافات نقية ، تليها التوصيف الجيني في المصب. يتم تحديد هوية أنواع الخميرة من خلال تسلسل منطقة الفواصل المنسوخة الداخلية (ITS) لمجموعة جينات الحمض النووي الريبوسومي النووي الريبوسومي ، في حين يتم استكشاف البنية السكانية العالمية ل A. fumigatus من خلال تحليل علامات الأقمار الصناعية الدقيقة.
تم تطبيق البروتوكول بنجاح لعزل وتوصيف خميرة التربة ومجموعات A. fumigatus في الكاميرون وكندا والصين وكوستاريكا وأيسلندا وبيرو ونيوزيلندا والمملكة العربية السعودية. كشفت هذه النتائج عن رؤى تشتد الحاجة إليها حول الأنماط العالمية في تنوع خميرة التربة ، وكذلك البنية السكانية العالمية وملامح مقاومة مضادات الفطريات ل A. fumigatus. تقدم هذه الورقة طريقة عزل كل من الخمائر و A. fumigatus من عينات التربة الدولية.
Introduction
تلعب الفطريات في النظم الإيكولوجية للتربة أدوارا أساسية في تحلل المواد العضوية ، وتدوير المغذيات ، وتخصيب التربة1. يستخدم كل من النهج المستقلة عن الثقافة (أي التسلسل عالي الإنتاجية) والنهج المعتمدة على الثقافة على نطاق واسع في دراسة فطريات التربة 2,3. وفي حين أن الكم الكبير من البيانات الناتجة عن تسلسل الباركود الفوقي عالي الإنتاجية مفيد لتوضيح الأنماط الواسعة النطاق في بنية المجتمع المحلي وتنوعه، فإن النهج المعتمد على الثقافة يمكن أن يوفر معلومات تكميلية للغاية عن الهياكل التصنيفية والوظيفية للمجتمعات الفطرية، فضلا عن ملامح أكثر تحديدا للكائنات الحية الفردية من خلال التنوع النهائي والتحليلات الوظيفية بسبب توافر الثقافات الفطرية النقية.
على الرغم من أنه نادرا ما يتجاوز آلاف الخلايا لكل غرام من التربة ، فإن الخمائر ، التي تعرف على نطاق واسع بأنها فطريات أحادية الخلية ، هي متحللات أساسية ومصادر غذائية لسكان التربة الآخرين 4,5. في الواقع ، قد تكون الخمائر هي فطريات التربة السائدة في المحيط الحيوي البارد مثل القارة القطبية الجنوبية 6,7. التربة هي أيضا خزان رئيسي للخمائر ذات الصلة طبيا التي تسبب التهابات انتهازية خطيرة في البشر والثدييات الأخرى8. على الرغم من أوجه التشابه المورفولوجية ، فإن أنواع الخميرة متنوعة من الناحية الفيلوجية وتحدث بين الفطريات الخيطية في اثنين من الفيلات الرئيسية ، Ascomycota و Basidiomycota ، داخل المملكة الفطرية9. تفتقر الخمائر إلى توقيع الحمض النووي المحدد في جين الترميز الشريطي الفطري ، وهو منطقة الفاصل الداخلي المنسوخة (ITS) في المجموعة الجينية النووية الريبوسومية RNA10 ، مما يجعلها لا يمكن تمييزها عن الفطريات الأخرى في تحقيقات metagenomics وبالتالي تتطلب استخدام طرق تعتمد على الثقافة لعزل أنواع الخميرة.
تم تنفيذ البروتوكول أدناه لتوصيف مجتمعات خميرة التربة في تسعة بلدان وتحديد الاتجاهات والأنماط العالمية في تنوع خميرة التربة9،11،12. مناهج الميتاجينوميكس محدودة الاستخدام عند دراسة المجموعات المستهدفة من الكائنات الحية مثل الخمائر 2,3. نظرا لتنوعها الجيني ، لا يمكن تمييز الخمائر عن الفطريات الأخرى بناء على تسلسل الحمض النووي وحده. وبالتالي ، فإن دراسة مجموعات الخميرة تتطلب الاستخدام المستمر للعزلة المعتمدة على الثقافة. ومع ذلك ، فإن الزراعة غالبا ما تكون أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب المزيد من الموظفين لإجراء التجارب. لذلك ، تم تحسين البروتوكول وتبسيطه لمعالجة أسرع مع عدد محدود من الموظفين. الميزة الرئيسية للزراعة هي أن أنواع الخميرة المحددة هي خمائر حية وليست ميتة ، وبالتالي من المرجح أن تكون من سكان التربة الحقيقيين بدلا من الخلايا العابرة الموجودة في التربة. تشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 40٪ من الحمض النووي الفطري في التربة إما ملوثات من بيئات أخرى ، أو خارج الخلية ، أو تأتي من خلايا لم تعد سليمة ، مما تسبب في نهج تسلسل عالية الإنتاجية للمبالغة في تقدير الثراء الفطري بنسبة تصل إلى 55٪ 13. يمكن للعزلة المعتمدة على الاستزراع أن تؤكد بسهولة هوية أنواع الخميرة مع فائدة إضافية تتمثل في تأمين الاستزراع النقي لاستخدامها في تحليلات المصب. في الواقع ، تم تحديد الثقافات النقية ل 44 نوعا جديدا من أنواع الخميرة المفترضة باستخدام بروتوكول عزل التربة هذا الذي سمح باستخدام مجموعة من الطرق لدراسة خصائصها التصنيفية والوظيفية بالتفصيل14.
يمكن أيضا استخدام البروتوكول أدناه لعزل القوالب الموجودة داخل التربة ، مثل A. fumigatus. Aspergillus fumigatus هو قالب محب للحرارة و saprophytic مع توزيع عالمي واسع في التربة15. وقد تم عزله من العديد من البيئات السريرية وغير السريرية. تشمل العينات غير السريرية عادة الهواء والحطام العضوي (السماد العضوي وغبار المنشار ونفايات لمبة الزنبق) والتربة (التربة الزراعية والحدائق والطبيعية)16،17،18،19. Aspergillus fumigatus هو عامل ممرض انتهازي بشري يسبب مجموعة من العدوى تسمى مجتمعة داء الرشاشيات ، وتؤثر على أكثر من 8 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم16,20. يعاني ما يقرب من 300000 شخص حول العالم من داء الرشاشيات الغازي ، وهو أشد أشكال داء الرشاشيات16. اعتمادا على عوامل مثل عدد المرضى ، وموقع العدوى ، وفعالية العلاج المضاد للفطريات ، يمكن أن يصل معدل الوفيات إلى 90٪. على مدى العقود العديدة الماضية، زادت مقاومة العلاجات المضادة للفطريات، مما يتطلب جهود مراقبة عالمية في كل من السكان السريريين والبيئيين لتتبع هذه الأنماط الجينية المقاومة21،22،23. نظرا لقدرتها على النمو في درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية ، يمكن استغلال درجة الحرارة هذه لاختيار A. fumigatus المعزولة عن التربة باستخدام طرق تعتمد على الثقافة. عادة ما يتم وضع النمط الوراثي لعزلات الرشاشيات المدخنة في تسعة مواقع متكررة قصيرة (STR) متعددة الأشكال للغاية ، والتي تبين أنها تتمتع بقوة تمييزية عالية بين السلالات24. يمكن مقارنة هذه الأنماط الجينية STR بالمجموعات السكانية الأخرى التي تم مسحها سابقا لتتبع انتشار الأنماط الجينية A. fumigatus ، بما في ذلك الجينات المقاومة للأدوية ، في جميع أنحاء العالم.
فيما يلي وصف لبروتوكول للعزل السريع للخمائر و A. fumigatus من عينات التربة بطريقة تعتمد على الثقافة. اعتمادا على كمية التربة التي تم الحصول عليها لكل عينة ، يمكن مشاركة عينات التربة بين البروتوكولين. بالمقارنة مع الطرق المماثلة التي تعزل الخميرة و A. fumigatus من التربة ، يستخدم هذا البروتوكول تربة أقل بمقدار 10 أضعاف لكل عزلة تم الحصول عليها. تتطلب الدراسات التي تحاول عزل A. fumigatus من التربة ما بين 1 و 2 غرام من التربة لكل عزلة ، في حين أن هذا البروتوكول يتطلب فقط 0.1-0.2 غرام من التربة18،19،25. يستخدم هذا البروتوكول مواد بلاستيكية وحاويات أصغر تسهل تصميمه عالي الإنتاجية. لذلك ، يمكن معالجة عدد أكبر من العينات باستخدام مساحة أقل لمعدات مثل الحاضنات وبراميل الأسطوانة. يمكن معالجة عينات التربة بالكامل للحصول على عزلات في أقل من 7 أيام. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح بمعالجة ما يصل إلى 150-200 عينة يوميا للشخص الواحد.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الذي تم تطويره لعزل الخمائر و A. fumigatus من التربة هو طريقة سريعة وفعالة لمعالجة التربة عالية الإنتاجية والعزل الفطري. ولا يتطلب البروتوكول سوى كمية صغيرة من التربة (0.1-0.2 جم) لكل عينة، مما يسمح بأخذ عينات من المزيد من المواقع بجهد مماثل. يضمن وقت الاستجابة السريع إمكانية الحصو?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال منح من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (رقم المنحة. ALLRP 570780-2021) وجامعة ماكماستر.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
