곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.
Summary
이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.
Abstract
토양은 엄청난 양의 미생물 생명체의 숙주이며, 각 그램에는 수십억 개의 박테리아, 고고 및 곰팡이 세포가 포함되어 있습니다. 효모로 광범위하게 정의 된 곰팡이 및 단세포 균류와 같은 다세포 균류는 유기 물질의 분해제 및 다른 토양 거주자를위한 식량원으로서 토양 생태계에서 필수적인 역할을 수행합니다. 토양의 곰팡이 종의 다양성은 강우량 및 온도와 같은 다양한 기후 요인뿐만 아니라 유기물, pH 및 수분을 포함한 토양 특성에 달려 있습니다. 특히 아시아, 아프리카, 남미 및 중앙 아메리카 지역에서 적절한 환경 샘플링이 부족하면 토양 곰팡이 공동체의 특성화와 새로운 종의 발견을 방해합니다.
우리는 ~ 4,000 토양 샘플과 효모와 곰팡이의 분리를 위해 실험실에서 개발 된 프로토콜을 사용하여 여섯 대륙의 아홉 개국의 토양 곰팡이 공동체를 특성화했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 성장을 억제하면서 액체 배지에서 효모와 의학적으로 관련된 곰팡이 Aspergillus fumigatus에 대한 별도의 선택적 농축으로 시작됩니다. 생성 된 콜로니는 고체 배지로 옮겨지고 순수한 배양물을 얻기 위해 추가로 처리되고 하류 유전 적 특성화가 뒤 따른다. 효모 종 동일성은 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터의 내부 전사 스페이서 (ITS) 영역의 시퀀싱을 통해 확립되며, A. fumigatus의 글로벌 인구 구조는 마이크로 위성 마커 분석을 통해 탐구됩니다.
이 프로토콜은 카메룬, 캐나다, 중국, 코스타리카, 아이슬란드, 페루, 뉴질랜드 및 사우디 아라비아의 토양 효모 및 A. fumigatus 개체군을 분리하고 특성화하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 발견은 토양 효모 다양성의 글로벌 패턴뿐만 아니라 A. fumigatus의 글로벌 인구 구조 및 항진균 저항 프로파일에 대한 많은 필요한 통찰력을 보여주었습니다. 이 논문은 국제 토양 샘플에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 방법을 제시합니다.
Introduction
토양 생태계의 곰팡이는 유기물 분해, 영양 순환 및 토양 시비에 필수적인 역할을합니다1. 배양-독립적(즉, 고처리량 시퀀싱) 및 배양-의존적 접근법 둘 모두는 토양 진균 2,3의 연구에 널리 사용된다. 고처리량 메타바코드 시퀀싱에 의해 생성된 다량의 데이터는 공동체 구조와 다양성의 광범위한 패턴을 밝히는 데 유용하지만, 문화 의존적 접근 방식은 순수한 곰팡이 배양의 가용성으로 인해 다운스트림 다양성 및 기능 분석을 통해 개별 유기체의 분류 및 기능 구조에 대한 매우 보완적인 정보뿐만 아니라 개별 유기체의 보다 구체적인 프로파일을 제공할 수 있습니다.
토양 그램 당 수천 개의 세포를 거의 초과하지 않음에도 불구하고, 단세포 균류로 광범위하게 정의 된 효모는 다른 토양 거주자 4,5에게 필수적인 분해제 및 식품 공급원입니다. 사실, 효모는 남극 대륙 6,7과 같은 차가운 생물권에서 우세한 토양 균류일 수 있다. 토양은 또한 인간과 다른 포유류에 심각한 기회 감염을 일으키는 의학적으로 관련된 효모의 주요 저수지입니다8. 형태학적 유사성에도 불구하고, 효모 종은 계통유전학적으로 다양하며, 진균 왕국 내에서 두 개의 주요 필라, Ascomycota 및 Basidiomycota의 필라멘트 진균 사이에서 발생한다9. 효모는 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터(10)의 내부 전사된 스페이서(ITS) 영역인 진균 바코딩 유전자에서 정의된 DNA 시그니처가 결여되어, 메타게놈학 조사에서 다른 진균과 구별할 수 없게 만들고, 따라서 효모 종을 분리하기 위한 배양-의존적 방법의 사용을 필요로 한다.
아래 프로토콜은 9 개국의 토양 효모 공동체를 특성화하고 토양 효모 다양성9,11,12의 세계적인 추세와 패턴을 식별하기 위해 구현되었습니다. 메타게놈학 접근법은 효모 2,3과 같은 유기체의 표적 집단을 연구할 때 제한적으로 사용된다. 그들의 계통 발생 다양성으로 인해, 효모는 DNA 서열만으로 다른 곰팡이와 구별 될 수 없습니다. 따라서 효모 개체군을 연구하려면 문화 의존적 격리를 지속적으로 사용해야합니다. 그러나 배양은 종종 훨씬 더 많은 시간이 걸리고 실험을 수행하는 데 더 많은 인력이 필요합니다. 따라서 프로토콜은 제한된 인력으로 더 빠른 처리를 위해 최적화되고 간소화되었습니다. 배양의 가장 큰 장점은 확인 된 효모 종은 죽은 효모가 아닌 살아있는 효모이므로 토양에 존재하는 일시적인 세포보다는 진정한 토양 거주자가 될 가능성이 더 높다는 것입니다. 토양의 곰팡이 DNA의 약 40 %는 다른 환경, 세포 외 오염 물질 또는 더 이상 손상되지 않은 세포에서 나온 것으로 추정되어 곰팡이 풍부도를 55 % 과대 평가하기위한 높은 처리량 시퀀싱 접근법을 유발합니다 13. 배양-의존적 분리는 하류 분석에 사용될 순수한 배양물을 확보하는 추가적인 이점으로 효모 종 동일성을 쉽게 확인할 수 있다. 실제로, 44 추정 새로운 효모 종의 순수한 배양은 분류 및 기능적 특성을 자세히 연구하기 위해 다양한 방법의 사용을 허용하는이 토양 분리 프로토콜을 사용하여 확인되었습니다14.
아래의 프로토콜은 또한 A. fumigatus와 같은 토양 내에 존재하는 곰팡이를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)는 토양15에 널리 분포되어 있는 고온성 및 보호성 곰팡이입니다. 그것은 수많은 임상 및 비 임상 환경에서 분리되었습니다. 비임상 샘플링에는 일반적으로 공기, 유기 파편 (퇴비, 톱 먼지, 튤립 전구 폐기물) 및 토양 (농업, 정원 및 자연 토양)16,17,18,19이 포함됩니다. 아스퍼질러스 후미가투스(Aspergillus fumigatus)는 아스퍼질라증(aspergillosis)이라고 불리는 다양한 감염을 일으키는 인간 기회주의적 병원체로, 전 세계 800만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치고16,20명에 이른다. 전 세계 약 300,000명의 사람들이 침습성 아스퍼질라증을 앓고 있으며, 이는 아스퍼질라증16의 가장 심각한 형태입니다. 환자 집단, 감염 부위 및 항진균 요법의 효능과 같은 요인에 따라 사망률은 90 %만큼 높을 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 항진균 요법에 대한 내성이 증가하여 임상 및 환경 인구 모두에서 이러한 내성 유전자형21,22,23을 추적하기위한 전 세계적인 감시 노력이 필요했습니다. 50 ° C 이상의 온도에서 자랄 수있는 능력을 감안할 때,이 온도는 배양 의존적 인 방법을 사용하여 토양에서 A. fumigatus 분리물을 선택하기 위해 악용 될 수 있습니다. 아스퍼질러스 푸미가투스 단리물은 일반적으로 아홉 개의 고도로 다형성 짧은 탠덤 반복(STR) 유전자좌에서 유전자형화되며, 균주24 사이에 높은 차별력을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 STR 유전자형은 약물 내성 유전자를 포함한 A. fumigatus 유전자형의 확산을 추적하기 위해 이전에 조사된 다른 개체군과 비교될 수 있다.
아래에서 우리는 효모와 A. fumigatus를 배양 의존적 인 방식으로 토양 샘플에서 신속하게 분리하기위한 프로토콜을 설명합니다. 샘플 당 수득된 토양의 양에 따라, 토양 샘플은 두 프로토콜 사이에서 공유될 수 있다. 토양에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 유사한 방법과 비교하여,이 프로토콜은 얻은 분리 물 당 10 배 적은 토양을 사용합니다. 토양에서 A. fumigatus를 분리하려는 연구는 분리 된 토양 당 1 ~ 2g의 토양을 필요로하지만,이 프로토콜은 0.1-0.2g의 토양18,19,25 만 필요로합니다. 이 프로토콜은 처리량이 높은 설계를 용이하게 하는 더 작은 플라스틱과 용기를 사용합니다. 따라서 인큐베이터 및 롤러 드럼과 같은 장비를위한 더 적은 공간을 사용하여 더 많은 수의 샘플을 처리 할 수 있습니다. 토양 샘플은 7 일 이내에 분리 물을 얻기 위해 완전히 처리 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 1 인당 하루에 최대 150-200 개의 샘플을 처리 할 수 있도록 최적화되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
토양에서 효모와 A. fumigatus 를 분리하기 위해 개발 된 프로토콜은 높은 처리량의 토양 처리 및 곰팡이 격리를위한 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜은 샘플 당 소량의 토양 (0.1-0.2g) 만 필요하므로 비슷한 노력으로 더 많은 사이트를 샘플링 할 수 있습니다. 빠른 처리 시간을 통해 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있으며 필요한 경우 문제 해결 및 반복 실험을 위한 시간을 허용합니다….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Grant No. ALLRP 570780-2021) 및 McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
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