JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

في الجسم الحي تصوير الأنسجة البيولوجية مع التألق المشترك ثنائي الفوتون والمجهر المجهري المبعثر رامان المحفز

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

يسمح الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) بالتصوير الخالي من الملصقات للجزيئات الحيوية بناء على اهتزازها الجوهري لروابط كيميائية محددة. في هذا البروتوكول ، يتم وصف الإعداد الفعال لمجهر SRS المتكامل والمجهر الفلوري ثنائي الفوتون لتصور الهياكل الخلوية في الحبل الشوكي للفئران الحية.

Abstract

يتيح الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) التصوير الخالي من الملصقات للأنسجة البيولوجية في بيئتها الدقيقة الطبيعية استنادا إلى الاهتزاز الجزيئي الجوهري ، وبالتالي توفير أداة مثالية لدراسة العمليات البيولوجية في الجسم الحي بدقة دون الخلايا. من خلال دمج التصوير الفلوري المثير ثنائي الفوتون (TPEF) في مجهر SRS ، يمكن للتصوير المزدوج الوسائط في الجسم الحي للأنسجة الحصول على معلومات كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية مهمة من وجهات نظر متعددة مما يساعد على فهم العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها التمثيل الغذائي الخلوي والاستجابة المناعية وإعادة تشكيل الأنسجة ، إلخ. في بروتوكول الفيديو هذا ، يتم تقديم إعداد نظام مجهر TPEF-SRS بالإضافة إلى طريقة التصوير في الجسم الحي للحبل الشوكي الحيواني. يلعب الحبل الشوكي ، كجزء من الجهاز العصبي المركزي ، دورا حاسما في التواصل بين الدماغ والجهاز العصبي المحيطي. غمد المايلين ، الوفير في الدهون الفوسفاتية ، يحيط بالمحور العصبي ويعزله للسماح بالتوصيل المالح لإمكانات العمل. في الجسم الحي التصوير من أغماد المايلين في الحبل الشوكي مهم لدراسة تطور الأمراض العصبية التنكسية وإصابة الحبل الشوكي. يصف البروتوكول أيضا إعداد الحيوانات وطرق التصوير TPEF-SRS في الجسم الحي للحصول على صور بيولوجية عالية الدقة.

Introduction

يظهر مجهر رامان 1,2 كطريقة قوية خالية من الملصقات لتصوير الأنسجة البيولوجية بناء على الترددات المميزة للروابط الكيميائية المختلفة في الجزيئات الحيوية. نظرا لقدرته على التصوير غير الغازية والتكيفية بشكل جيد ، تم استخدام مجهر رامان على نطاق واسع لتصوير المكونات الغنية بالدهون في الأنسجة البيولوجية مثل غمد المايلين 3،4،5 ، الخلايا الشحمية6،7 ، وقطرات الدهون 8،9،10 . إشارة تشتت رامان المحفزة (SRS) المكتسبة ككسب رامان محفز (SRG) أو فقدان رامان محفز (SRL) خالية من الخلفية ، وتظهر تشابها طيفيا مثاليا مع تشتت رامان التلقائي 11,12. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد SRL و SRG خطيا على تركيز التحليل ، مما يسمح بالتحليل الكمي للمكونات الكيميائية الحيوية 9،11،13. تم استخدام المجهر الفلوري المثير ثنائي الفوتون (TPEF) على نطاق واسع للتصوير البيولوجي في الجسم الحي بسبب قدرته المتأصلة على التقسيم البصري ، وعمق الاختراق العميق ، وانخفاض السمية الضوئية 14،15،16. ومع ذلك ، يعتمد أداء تصوير TPEF على خصائص علامات الفلورسنت ، وعدد الألوان القابلة للحل محدود بسبب أطياف التألق عريض النطاق8،17،18،19. يعد تصوير SRS الخالي من الملصقات وتصوير TPEF القائم على التألق طريقتين للتصوير التكميلي ، ويمكن أن يوفر مزيجهما معلومات فيزيائية حيوية وكيميائية حيوية وفيرة للأنسجة. تعتمد هاتان الطريقتان للتصوير على العمليات البصرية غير الخطية (NLO) ، والتي تسمح بالتكامل البسيط في نظام مجهري واحد. يتيح الجمع بين التصوير SRS و TPEF ، ما يسمى بالتصوير ثنائي الوسائط ، التصوير عالي الأبعاد وتوصيف الخلايا والأنسجة ، مما يسهل فهما شاملا للأنظمة البيولوجية المعقدة. وعلى وجه التحديد، يمكن للفحص المجهري للبيكوثانية (ps) SRS تحقيق تصوير الرابطة الكيميائية بدقة طيفية عالية مقارنة بتقنية الفيمتو ثانية (fs) SRS11، مما يسمح بالتمييز بين مكونات كيميائية حيوية متعددة في الأنسجة البيولوجية، خاصة في منطقة بصمات الأصابع المزدحمة20،21. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع نظام مجهر NLO مزدوج الوسائط شائع الاستخدام مع دمج مجهر متماسك مضاد لتشتت ستوكس (CARS)، يظهر SRS أداء متفوقا على CARS من حيث التفسير الطيفي والصورة وكذلك حساسية الكشف11. تم استخدام مجهر SRS-TPEF كأداة قوية لدراسة الأنظمة البيولوجية المختلفة ، مثل Caenorhabditis elegans9,22 ، Xenopus laevis tadpole brain5 ، دماغ الفأر 23,24 ، الحبل الشوكي 25,26 ، العصب المحيطي 27 ، والأنسجة الدهنية7 ، إلخ.

يشكل الحبل الشوكي مع الدماغ الجهاز العصبي المركزي (CNS). يعد تصور الأنشطة الخلوية في الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات اضطرابات الجهاز العصبي المركزي28،29،30 ولتطوير العلاجات المقابلة31،32،33. يلعب غمد المايلين ، الذي يلف ويعزل المحاور العصبية للتوصيل المحتمل للعمل عالي السرعة ، دورا مهما في تطوير الجهاز العصبي المركزي. يعتقد أن إزالة الميالين هي السمة المميزة في اضطرابات المادة البيضاء، مثل التصلب المتعدد34. بالإضافة إلى ذلك ، بعد إصابة الحبل الشوكي35 ، يمكن لحطام المايلين تعديل تنشيط البلاعم ، مما يساهم في الالتهاب المزمن والإصابة الثانوية36. لذلك ، فإن التصوير في الجسم الحي لغمد المايلين مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في نماذج الفئران الحية يساعد بشكل كبير على فهم العمليات الديناميكية في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراءات الإعداد الأساسية لمجهر TPEF-SRS المصنوع في المنزل ويتم تقديم طرق التصوير ثنائية الوسائط في الجسم الحي للحبل الشوكي للفأر.

Protocol

يتم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية التي يتم تنفيذها في هذا العمل وفقا للمبادئ التوجيهية لمرفق المختبر التابع لجامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا (HKUST) وقد تمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في HKUST. مطلوب تدريب على السلامة للتعامل مع الليزر لإعداد وتشغيل مجهر TPEF-SRS. دائما ارتد…

Representative Results

في الجسم الحي ، يتم إجراء التصوير ثنائي الوسائط للمحاور الشوكية وكذلك أغماد المايلين باستخدام الفئران المعدلة وراثيا Thy1-YFPH ، والتي تعبر عن EYFP في الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (الشكل 3). تنقل هذه الخلايا العصبية القريبة المعلومات الحسية من العصب المحيطي إلى ?…

Discussion

في هذا البروتوكول ، يتم وصف الإعداد الأساسي لمجهر TPEF-SRS بالتفصيل. بالنسبة لتصوير SRS ، تتداخل المضخة وحزم Stokes زمنيا ومكانيا داخل OPO. ومع ذلك ، يمكن تعطيل هذا التداخل بعد المرور عبر نظام المجهر. لذلك ، فإن كل من التحسين المكاني والزماني للتوطين المشترك للمضخة وعوارض ستوكس ضروري وحاسم لتحقيق ا?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس هونغ كونغ للمنح البحثية من خلال المنح 16103215 16148816 16102518 16102920 و T13-607/12R و T13-706/11-1 و T13-605/18W و C6002-17GF و C6001-19E و N_HKUST603/19 ولجنة الابتكار والتكنولوجيا (ITCPD/17-9) ومخطط مجال التميز للجنة المنح الجامعية (AoE / M-604/16 و AOE / M-09/12) وجامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا (HKUST) من خلال المنحة RPC10EG33.

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

Tags

In Vivo ImagingTwo-photon FluorescenceStimulated Raman ScatteringMicroscopySubcellular ResolutionChemical SpecificityCellular MetabolismImmune ResponseNeurodegenerative DiseasesSpinal Cord InjuryTitanium Sapphire LaserOPOPhotodetectorOscilloscopeEOMPump LaserWavelengthOptical Alignment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image