Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi tillader etiketfri billeddannelse af biomolekyler baseret på deres iboende vibration af specifikke kemiske bindinger. I denne protokol beskrives den instrumentelle opsætning af et integreret SRS og to-fotonfluorescensmikroskop for at visualisere cellulære strukturer i rygmarven hos levende mus.
Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi muliggør etiketfri billeddannelse af det biologiske væv i dets naturlige mikromiljø baseret på iboende molekylær vibration, hvilket giver et perfekt værktøj til in vivo-undersøgelse af biologiske processer ved subcellulær opløsning. Ved at integrere to-foton ophidset fluorescens (TPEF) billeddannelse i SRS-mikroskopet kan den dobbeltmodale in vivo-billeddannelse af væv erhverve kritisk biokemisk og biofysisk information fra flere perspektiver, som hjælper med at forstå de dynamiske processer, der er involveret i cellulær metabolisme, immunrespons og vævsombygning osv. I denne videoprotokol introduceres opsætningen af et TPEF-SRS-mikroskopsystem samt in vivo-billeddannelsesmetoden for dyrets rygmarv. Rygmarven, som en del af centralnervesystemet, spiller en kritisk rolle i kommunikationen mellem hjernen og det perifere nervesystem. Myelinskede, der er rigelig i phospholipider, omgiver og isolerer axonen for at tillade saltholdig ledning af aktionspotentialer. In vivo-billeddannelse af myelinskeder i rygmarven er vigtig for at studere progressionen af neurodegenerative sygdomme og rygmarvsskade. Protokollen beskriver også dyrepræparationer og in vivo TPEF-SRS-billeddannelsesmetoder til at erhverve biologiske billeder i høj opløsning.
Ramanmikroskopi1,2 fremstår som en kraftfuld etiketfri metode til at afbilde biologisk væv baseret på de karakteristiske frekvenser af forskellige kemiske bindinger i biomolekyler. På grund af sin ikke-invasive og veladaptive billeddannelsesevne er Raman-mikroskopi i vid udstrækning blevet anvendt til billeddannelse af lipidberigede komponenter i biologiske væv som myelinskede3,4,5, adipocytter6,7 og lipiddråber8,9,10 . Stimuleret Raman scattering (SRS) signal erhvervet som stimuleret Raman gain (SRG) eller stimuleret Raman tab (SRL) er baggrundsfrit, hvilket viser perfekt spektral lighed med spontan Raman spredning11,12. Derudover er SRL og SRG lineært afhængige af analytkoncentrationen, hvilket muliggør kvantitativ analyse af biokemiske komponenter9,11,13. To-foton ophidset fluorescensmikroskopi (TPEF) er blevet anvendt i vid udstrækning til in vivo biologisk billeddannelse på grund af dets iboende optiske sektioneringsevne, dybe penetrationsdybde og lave fototoksicitet14,15,16. Udførelsen af TPEF-billeddannelse afhænger imidlertid af egenskaberne ved fluorescerende tags, og antallet af opløselige farver er begrænset på grund af bredbåndsfluorescensspektrene8,17,18,19. Etiketfri SRS-billeddannelse og fluorescensbaseret TPEF-billeddannelse er to komplementære billeddannelsesmetoder, og deres kombination kan give rigelig biofysisk og biokemisk information om væv. Disse to billeddannelsesmetoder er begge baseret på de ikke-lineære optiske (NLO) processer, som muliggør enkel integration i et mikroskopsystem. Kombinationen af SRS- og TPEF-billeddannelsen, den såkaldte dual-modal imaging, muliggør højdimensionel billeddannelse og profilering af celler og væv, hvilket letter en omfattende forståelse af komplekse biologiske systemer. Specifikt kan picosekund (ps) SRS-mikroskopi opnå kemisk bindingsbilleddannelse med høj spektral opløsning sammenlignet med femtosekund (fs) SRS-teknik11, hvilket gør det muligt at differentiere flere biokemiske komponenter i biologisk væv, især i det overfyldte fingeraftryksområde20,21. Sammenlignet med et andet almindeligt anvendt dobbeltmodalt NLO-mikroskopsystem med integration af sammenhængende anti-Stokes scattering (CARS) mikroskop viser SRS desuden overlegen ydeevne i forhold til CARS med hensyn til spektral- og billedfortolkning samt detektionsfølsomhed11. SRS-TPEF-mikroskopet er blevet brugt som et kraftfuldt værktøj til at studere forskellige biologiske systemer, såsom Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, musehjerne23,24, rygmarv25,26, perifer nerve27 og fedtvæv7 osv.
Rygmarven udgør sammen med hjernen centralnervesystemet (CNS). Visualisering af cellulære aktiviteter i CNS in vivo under fysiologiske og patologiske tilstande er afgørende for at forstå mekanismerne for CNS-lidelser28,29,30 og for at udvikle tilsvarende terapier31,32,33. Myelinskede, der ombryder og isolerer axoner til højhastighedsvirkende potentiel ledning, spiller en væsentlig rolle i udviklingen af CNS. Demyelination betragtes som et kendetegn ved hvide substansforstyrrelser, såsom multipel sklerose34. Efter rygmarvsskade35 kan myelinaffald desuden modulere makrofagaktivering, hvilket bidrager til kronisk inflammation og sekundær skade36. Derfor er in vivo-billeddannelse af myelinskede sammen med neuroner og gliaceller i levende musemodeller til stor hjælp til at forstå de dynamiske processer i CNS-lidelser.
I denne protokol beskrives de grundlæggende opsætningsprocedurer for et hjemmebygget TPEF-SRS-mikroskop, og de dobbeltmodale in vivo-billeddannelsesmetoder til musens rygmarv introduceres.
I denne protokol beskrives den grundlæggende opsætning af TPEF-SRS-mikroskopet detaljeret. Til SRS-billeddannelse overlappes pumpen og Stokes-strålerne tidsmæssigt og rumligt inde i OPO’en. Denne overlapning kan dog forstyrres efter at have passeret mikroskopsystemet. Derfor er både rumlig og tidsmæssig optimering af colokaliseringen af pumpen og Stokes-bjælkerne nødvendig og kritisk for at opnå optimal SRS-billeddannelse. Den tidsmæssige forsinkelse mellem pumpen og Stokes-strålen er relateret til den optisk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Hong Kong Research Grants Council gennem tilskud 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), Area of Excellence Scheme fra University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) og Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) gennem tilskud RPC10EG33.
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |