La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.
La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des tissus biologiques dans son microenvironnement naturel basée sur la vibration moléculaire intrinsèque, fournissant ainsi un outil parfait pour l’étude in vivo des processus biologiques à résolution subcellulaire. En intégrant l’imagerie par fluorescence excitée à deux photons (TPEF) dans le microscope SRS, l’imagerie in vivo bimodale des tissus peut acquérir des informations biochimiques et biophysiques critiques à partir de multiples perspectives qui aident à comprendre les processus dynamiques impliqués dans le métabolisme cellulaire, la réponse immunitaire et le remodelage des tissus, etc. Dans ce protocole vidéo, la configuration d’un système de microscope TPEF-SRS ainsi que la méthode d’imagerie in vivo de la moelle épinière animale sont introduites. La moelle épinière, en tant que partie du système nerveux central, joue un rôle essentiel dans la communication entre le cerveau et le système nerveux périphérique. La gaine de myéline, abondante en phospholipides, entoure et isole l’axone pour permettre la conduction saltatoire des potentiels d’action. L’imagerie in vivo des gaines de myéline dans la moelle épinière est importante pour étudier la progression des maladies neurodégénératives et des lésions de la moelle épinière. Le protocole décrit également la préparation animale et les méthodes d’imagerie TPEF-SRS in vivo pour acquérir des images biologiques à haute résolution.
La microscopie Raman1,2 est en train de devenir une puissante méthode sans étiquette pour imager les tissus biologiques en fonction des fréquences caractéristiques de diverses liaisons chimiques dans les biomolécules. En raison de sa capacité d’imagerie non invasive et bien adaptative, la microscopie Raman a été largement utilisée pour l’imagerie de composants enrichis en lipides dans des tissus biologiques tels que la gaine de myéline3,4,5, les adipocytes6,7 et les gouttelettes lipidiques8,9,10 . Le signal de diffusion Raman stimulée (SRS) acquis sous forme de gain Raman stimulé (SRG) ou de perte Raman stimulée (SRL) est sans arrière-plan, montrant une ressemblance spectrale parfaite avec la diffusion Raman spontanée11,12. De plus, le SRL et le SSR dépendent linéairement de la concentration de l’analyte, ce qui permet une analyse quantitative des composants biochimiques9,11,13. La microscopie à fluorescence excitée à deux photons (TPEF) a été largement utilisée pour l’imagerie biologique in vivo en raison de sa capacité de sectionnement optique inhérente, de sa profondeur de pénétration profonde et de sa faible phototoxicité14,15,16. Cependant, les performances de l’imagerie TPEF dépendent des caractéristiques des étiquettes fluorescentes, et le nombre de couleurs résolvables est limité en raison des spectres de fluorescence à large bande8,17,18,19. L’imagerie SRS sans étiquette et l’imagerie TPEF basée sur la fluorescence sont deux modalités d’imagerie complémentaires, et leur combinaison peut fournir des informations biophysiques et biochimiques abondantes sur les tissus. Ces deux modalités d’imagerie sont toutes deux basées sur les processus optiques non linéaires (NLO), ce qui permet une intégration simple dans un système de microscope. La combinaison de l’imagerie SRS et TPEF, appelée imagerie dual-modale, permet l’imagerie et le profilage de haute dimension des cellules et des tissus, facilitant ainsi une compréhension complète des systèmes biologiques complexes. Plus précisément, la microscopie SRS picoseconde (ps) permet d’obtenir une imagerie de liaison chimique avec une résolution spectrale élevée par rapport à la technique SRS femtoseconde (fs)11, permettant de différencier plusieurs composants biochimiques dans les tissus biologiques, en particulier dans la région d’empreintes digitales encombrée20,21. En outre, par rapport à un autre système de microscope NLO bimodal couramment utilisé avec intégration d’un microscope à diffusion anti-Stokes cohérente (CARS), SRS montre des performances supérieures à CARS en termes d’interprétation spectrale et d’image ainsi que de sensibilité de détection11. Le microscope SRS-TPEF a été utilisé comme un outil puissant pour étudier divers systèmes biologiques, tels que Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cerveau de souris23,24, moelle épinière25,26, nerf périphérique27 et tissu adipeux7, etc.
La moelle épinière et le cerveau constituent le système nerveux central (SNC). La visualisation des activités cellulaires dans le SNC in vivo dans des conditions physiologiques et pathologiques est essentielle pour comprendre les mécanismes des troubles du SNC28,29,30 et pour développer des thérapies correspondantes31,32,33. La gaine de myéline, qui enveloppe et isole les axones pour une conduction potentielle d’action à grande vitesse, joue un rôle important dans le développement du SNC. La démyélinisation est considérée comme une caractéristique dans les troubles de la substance blanche, tels que la sclérose en plaques34. De plus, après une lésion de la moelle épinière35, les débris de myéline peuvent moduler l’activation des macrophages, contribuant ainsi à l’inflammation chronique et aux lésions secondaires36. Par conséquent, l’imagerie in vivo de la gaine de myéline avec les neurones et les cellules gliales dans des modèles murins vivants est d’une grande aide pour comprendre les processus dynamiques dans les troubles du SNC.
Dans ce protocole, les procédures de configuration fondamentales d’un microscope TPEF-SRS construit à la maison sont décrites et les méthodes d’imagerie in vivo bimodales pour la moelle épinière de souris sont introduites.
Dans ce protocole, la configuration de base du microscope TPEF-SRS est décrite en détail. Pour l’imagerie SRS, la pompe et les faisceaux stokes se chevauchent temporellement et spatialement à l’intérieur de l’OPO. Cependant, ce chevauchement peut être perturbé après le passage dans le système de microscope. Par conséquent, l’optimisation spatiale et temporelle de la colocalisation de la pompe et des faisceaux de Stokes est nécessaire et essentielle pour obtenir une imagerie SRS optimale. Le délai temp…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Hong Kong Research Grants Council par le biais de subventions 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Commission de l’innovation et de la technologie (ITCPD/17-9), le programme de domaine d’excellence du Comité des subventions universitaires (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) et l’Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST) par le biais de la subvention RPC10EG33.
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |