Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Summary

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Abstract

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ermöglicht eine markierungsfreie Abbildung des biologischen Gewebes in seiner natürlichen Mikroumgebung auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungen und ist somit ein perfektes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung biologischer Prozesse bei subzellulärer Auflösung. Durch die Integration der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzbildgebung (TPEF) in das SRS-Mikroskop kann die dual-modale In-vivo-Bildgebung von Geweben kritische biochemische und biophysikalische Informationen aus mehreren Perspektiven erfassen, die helfen, die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau usw. beteiligt sind. In diesem Videoprotokoll wird der Aufbau eines TPEF-SRS-Mikroskopsystems sowie das in vivo bildgebende Verfahren des tierischen Rückenmarks vorgestellt. Das Rückenmark spielt als Teil des zentralen Nervensystems eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem peripheren Nervensystem. Myelinscheide, die reich an Phospholipiden ist, umgibt und isoliert das Axon, um eine salzige Leitung von Aktionspotentialen zu ermöglichen. Die In-vivo-Bildgebung von Myelinscheiden im Rückenmark ist wichtig, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt auch die Tierpräparation und in vivo TPEF-SRS-Bildgebungsverfahren zur Aufnahme hochauflösender biologischer Bilder.

Introduction

Die Raman-Mikroskopie1,2 entwickelt sich zu einer leistungsstarken markierungsfreien Methode^, um biologisches Gewebe basierend auf den charakteristischen Frequenzen verschiedener chemischer Bindungen in Biomolekülen abzubilden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven und gut adaptiven Bildgebungsfähigkeit wurde die Raman-Mikroskopie häufig für die Bildgebung von lipidangereicherten Komponenten in biologischen Geweben wie Myelinscheide3,4,5, Adipozyten6,7 und Lipidtröpfchen eingesetzt8,9,10 . Das Signal der stimulierten Raman-Streuung (SRS), das als stimulierter Raman-Gewinn (SRG) oder stimulierter Raman-Verlust (SRL) erfasst wird, ist hintergrundfrei und zeigt eine perfekte spektrale Ähnlichkeit mit spontaner Raman-Streuung11,12. Darüber hinaus sind SRL und SRG linear von der Analytkonzentration abhängig, was eine quantitative Analyse der biochemischen Komponenten ermöglicht9,11,13. Die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (TPEF) wurde aufgrund ihrer inhärenten optischen Schnittfähigkeit, tiefen Eindringtiefe und geringen Phototoxizität häufig für die biologische In-vivo-Bildgebung eingesetzt14,15,16^. Die Leistung der TPEF-Bildgebung hängt jedoch von den Eigenschaften fluoreszierender Tags ab, und die Anzahl der auflösbaren Farben ist aufgrund der breitbandigen Fluoreszenzspektren ^{begrenzt8,17,18,19}. Markierungsfreie SRS-Bildgebung und fluoreszenzbasierte TPEF-Bildgebung sind zwei komplementäre Bildgebungsmodalitäten, und ihre Kombination kann reichlich biophysikalische und biochemische Informationen über Gewebe liefern. Diese beiden Bildgebungsmodalitäten basieren beide auf den nichtlinearen optischen (NLO) Prozessen, die eine einfache Integration in ein Mikroskopsystem ermöglichen. Die Kombination der SRS- und TPEF-Bildgebung, die sogenannte dual-modale Bildgebung, ermöglicht eine hochdimensionale Bildgebung und Profilierung von Zellen und Geweben und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis komplexer biologischer Systeme. Insbesondere kann die Pikosekunden-SRS-Mikroskopie eine chemische Bindungsbildgebung mit hoher spektraler Auflösung im Vergleich zur Femtosekunden-SRS-Technik (fs⁾¹¹ erreichen, die es ermöglicht, mehrere biochemische Komponenten in biologischem Gewebe zu unterscheiden, insbesondere in der überfüllten Fingerabdruckregion20,21^. Darüber hinaus zeigt SRS im Vergleich zu einem anderen häufig verwendeten dual-modalen NLO-Mikroskopsystem mit Integration eines kohärenten Anti-Stokes-Streumikroskops (CARS) eine überlegene Leistung gegenüber CARS in Bezug auf Spektral- und Bildinterpretation sowie ^{Detektionsempfindlichkeit11.} Das SRS-TPEF-Mikroskop wurde als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung verschiedener biologischer Systeme verwendet, wie Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis Kaulquappengehirn5, Mausgehirn23,24, Rückenmark25,26^, peripherer ^Nerv27 und ^Fettgewebe7 usw.

Das Rückenmark bildet zusammen mit dem Gehirn das zentrale Nervensystem (ZNS). Die Visualisierung zellulärer Aktivitäten im ZNS in vivo unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von ZNS-Erkrankungen28,29,30 und für die Entwicklung entsprechender Therapien31,32,33^. Die Myelinscheide, die Axone für eine Hochgeschwindigkeits-Wirkungspotentialleitung umhüllt und isoliert, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Die Demyelinisierung gilt als Kennzeichen bei Erkrankungen der weißen Substanz wie der ^{Multiplen Sklerose34.} Darüber hinaus können Myelinreste nach einer Rückenmarksverletzung35 die Makrophagenaktivierung modulieren, was zu chronischen Entzündungen und Sekundärverletzungen ^beiträgt36. Daher ist die In-vivo-Bildgebung von Myelinhüllen zusammen mit Neuronen und Gliazellen in lebenden Mausmodellen eine große Hilfe, um die dynamischen Prozesse bei ZNS-Erkrankungen zu verstehen.

In diesem Protokoll werden die grundlegenden Setup-Verfahren eines selbst gebauten TPEF-SRS-Mikroskops beschrieben und die dual-modalen In-vivo-Bildgebungsverfahren für das Rückenmark der Maus vorgestellt.

Protocol

Alle Tierverfahren, die bei dieser Arbeit durchgeführt werden, werden gemäß den Richtlinien der Laboratory Animal Facility der Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) durchgeführt und von der Tierethikkommission der HKUST genehmigt. Für die Einrichtung und Bedienung des TPEF-SRS-Mikroskops ist eine Sicherheitsschulung für die Laserhandhabung erforderlich. Tragen Sie immer eine Laserschutzbrille mit entsprechendem Wellenlängenbereich, wenn es um Laser geht. 1. Aufbau…

Representative Results

Die in vivo dual-modale Bildgebung von spinalen Axonen sowie Myelinscheiden wird mit den transgenen Thy1-YFPH-Mäusen durchgeführt, die EYFP in afferenten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions exprimieren (Abbildung 3). Diese gekennzeichneten afferenten Neuronen leiten die sensorischen Informationen vom peripheren Nerv an das Rückenmark weiter, wobei sich der zentrale Ast in der Rückenmarksdorsalsäule befindet. Mit dem TPEF-SRS-Mikroskop können dicht verteilte Myelinhüllen mit…

Discussion

In diesem Protokoll wird der grundlegende Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops ausführlich beschrieben. Für die SRS-Bildgebung sind die Pumpe und die Stokes-Strahlen innerhalb des OPO zeitlich und räumlich überlappt. Diese Überlappung kann jedoch nach dem Durchlaufen des Mikroskopsystems unterbrochen werden. Daher ist sowohl die räumliche als auch die zeitliche Optimierung der Kolokalisation der Pumpe und der Stokes-Träger notwendig und entscheidend, um eine optimale SRS-Bildgebung zu erreichen. Die zeitliche Verzöger…

Materials

#2 Forceps	Dumont	11223-20	For laminectomy
10X objective	Nikon	CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective	Olympus	XLPLN25XSVMP2
Burn cream	Betadine
Camera	Sony	α6300
Current amplifier	Stanford research	SR570
Current photomultiplier modules	Hamamatsu	H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror	Semrock	FF665-Di02-25×36	For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror	Edmund	69-206	For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream	Veet
FS1 975 nm short-pass filter	Edmund	86-108	For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter	Semrock	FF01-850/310	For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter	Semrock	FF01-525/50	For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter	Semrock	FF01-715/SP-25	For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate	Thorlabs	SAHWP05M-1700
High-speed photodetector	MenloSystems	FPD 310-F	For checking Stokes beam modulation
Iodine	Betadine
IR Scope	FJW	FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris	Thorlabs	CPA1
L1	Thorlabs	AC254-060-B-ML
L10	Thorlabs	LA4052-A
L2	Thorlabs	LA1422-B
L3	Thorlabs	AC254-050-B
L4	Thorlabs	AC254-060-B-ML
L7			f=100 mm, AB coating
L8	Thorlabs	LA4874-A
L9	Thorlabs	AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier	APE
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01
Motorized flipper	Thorlabs	MFF101/M
multifunctional acquisition card	National Instrument	PCIe-6363
Oscilloscope	Tektronix	TDS2012C
Photodiode	APE		For detecting SRS signal
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Polarizing beam splitter	Thorlabs	CCM1-PBS252/M
Power meter	Newport	843-R
Saline	Braun
Scan lens L5	Thorlabs	SL50-CLS2
Scanning mirror	Cambridge Technology	6215H
Silicone gel	World Precision Inc.	KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser	Coherent	Chameleon Ultra II
Tube lens L6	Thorlabs	TTL200-S8