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Bio-ingénierie

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l’imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

Abstract

La microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS) consente l’imaging senza etichette dei tessuti biologici nel suo microambiente naturale basato sulla vibrazione molecolare intrinseca, fornendo così uno strumento perfetto per lo studio in vivo dei processi biologici a risoluzione subcellulare. Integrando l’imaging a fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) nel microscopio SRS, l’imaging dual-modal in vivo dei tessuti può acquisire informazioni biochimiche e biofisiche critiche da più prospettive che aiutano a comprendere i processi dinamici coinvolti nel metabolismo cellulare, nella risposta immunitaria e nel rimodellamento dei tessuti, ecc. In questo protocollo video, viene introdotta la configurazione di un sistema di microscopio TPEF-SRS e il metodo di imaging in vivo del midollo spinale animale. Il midollo spinale, come parte del sistema nervoso centrale, svolge un ruolo fondamentale nella comunicazione tra il cervello e il sistema nervoso periferico. La guaina mielinica, abbondante nei fosfolipidi, circonda e isola l’assone per consentire la conduzione saltatoria dei potenziali d’azione. L’imaging in vivo delle guaine mieliniche nel midollo spinale è importante per studiare la progressione delle malattie neurodegenerative e delle lesioni del midollo spinale. Il protocollo descrive anche la preparazione animale e i metodi di imaging TPEF-SRS in vivo per acquisire immagini biologiche ad alta risoluzione.

Introduction

La microscopia Raman1,2 sta emergendo come un potente metodo senza etichetta per l’immagine di tessuti biologici basati sulle frequenze caratteristiche di vari legami chimici nelle biomolecole. Grazie alla sua capacità di imaging non invasiva e ben adattativa, la microscopia Raman è stata ampiamente utilizzata per l’imaging di componenti arricchiti di lipidi nei tessuti biologici come la guaina mielinica3,4,5, gli adipociti6,7 e le goccioline lipidiche8,9,10 . Il segnale di scattering Raman stimolato (SRS) acquisito come guadagno Raman stimolato (SRG) o perdita Raman stimolata (SRL) è privo di sfondo, mostrando una perfetta somiglianza spettrale con lo scattering Raman spontaneo11,12. Inoltre, SRL e SSR dipendono linearmente dalla concentrazione di analiti, consentendo l’analisi quantitativa dei componenti biochimici9,11,13. La microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) è stata ampiamente utilizzata per l’imaging biologico in vivo grazie alla sua intrinseca capacità di sezionamento ottico, profondità di penetrazione profonda e bassa fototossicità14,15,16. Tuttavia, le prestazioni dell’imaging TPEF dipendono dalle caratteristiche dei tag fluorescenti e il numero di colori risolvibili è limitato a causa degli spettri di fluorescenza a banda larga8,17,18,19. L’imaging SRS senza etichette e l’imaging TPEF basato sulla fluorescenza sono due modalità di imaging complementari e la loro combinazione può fornire abbondanti informazioni biofisiche e biochimiche sui tessuti. Queste due modalità di imaging sono entrambe basate sui processi ottici non lineari (NLO), che consentono una semplice integrazione in un unico sistema di microscopio. La combinazione dell’imaging SRS e TPEF, il cosiddetto imaging dual-modale, consente l’imaging ad alta dimensione e la profilazione di cellule e tessuti, facilitando una comprensione completa di sistemi biologici complessi. In particolare, la microscopia SRS a picosecondi (ps) può ottenere l’imaging del legame chimico con un’elevata risoluzione spettrale rispetto alla tecnica SRS a femtosecondi (fs)11, consentendo di differenziare più componenti biochimici nel tessuto biologico, specialmente nella regione affollata delle impronte digitali20,21. Inoltre, rispetto a un altro sistema di microscopio NLO dual-modale comunemente usato con integrazione del microscopio a dispersione coerente anti-Stokes (CARS), SRS mostra prestazioni superiori a CARS in termini di interpretazione spettrale e dell’immagine, nonché sensibilità di rilevamento11. Il microscopio SRS-TPEF è stato utilizzato come potente strumento per studiare vari sistemi biologici, come Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, mouse brain23,24, midollo spinale25,26, nervo periferico27 e tessuto adiposo7, ecc.

Il midollo spinale insieme al cervello costituisce il sistema nervoso centrale (SNC). Visualizzare le attività cellulari nel SNC in vivo in condizioni fisiologiche e patologiche è fondamentale per comprendere i meccanismi dei disturbi del SNC28,29,30 e per sviluppare terapie corrispondenti31,32,33. La guaina mielinica, che avvolge e isola gli assoni per la conduzione del potenziale d’azione ad alta velocità, svolge un ruolo significativo nello sviluppo del SNC. La demielinizzazione è considerata un segno distintivo nei disturbi della sostanza bianca, come la sclerosi multipla34. Inoltre, dopo una lesione del midollo spinale35, i detriti mielinici possono modulare l’attivazione dei macrofagi, contribuendo all’infiammazione cronica e alle lesioni secondarie36. Pertanto, l’imaging in vivo della guaina mielinica insieme ai neuroni e alle cellule gliali in modelli murini viventi è di grande aiuto per comprendere i processi dinamici nei disturbi del SNC.

In questo protocollo, vengono descritte le procedure di configurazione fondamentali di un microscopio TPEF-SRS costruito in casa e vengono introdotti i metodi di imaging in vivo dual-modal per il midollo spinale del topo.

Protocol

Tutte le procedure animali eseguite in questo lavoro sono condotte secondo le linee guida del Laboratory Animal Facility della Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) e sono state approvate dal Comitato etico animale di HKUST. La formazione sulla sicurezza per la manipolazione laser è necessaria per configurare e utilizzare il microscopio TPEF-SRS. Indossare sempre occhiali di sicurezza laser con un intervallo di lunghezze d’onda appropriato quando si ha a che fare con il laser. …

Representative Results

L’imaging dual-modale in vivo degli assoni spinali e delle guaine mieliniche viene condotto utilizzando i topi transgenici Thy1-YFPH, che esprimono EYFP nei neuroni afferenti del ganglio della radice dorsale (Figura 3). Questi neuroni afferenti etichettati trasmettono le informazioni sensoriali dal nervo periferico al midollo spinale, con il ramo centrale situato nella colonna dorsale del midollo spinale. Con il microscopio TPEF-SRS, la guaina mielinica densamente distribuita può e…

Discussion

In questo protocollo, la configurazione di base del microscopio TPEF-SRS è descritta in dettaglio. Per l’imaging SRS, la pompa e i fasci di Stokes sono sovrapposti temporalmente e spazialmente all’interno dell’OPO. Tuttavia, questa sovrapposizione può essere interrotta dopo aver attraversato il sistema del microscopio. Pertanto, l’ottimizzazione spaziale e temporale della colocalizzazione della pompa e dei fasci di Stokes è necessaria e fondamentale per ottenere un’imaging SRS ottimale. Il ritardo temporale tra la po…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dall’Hong Kong Research Grants Council attraverso sovvenzioni 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Commissione per l’innovazione e la tecnologia (ITCPD/17-9), l’Area of Excellence Scheme del Comitato per le sovvenzioni universitarie (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) e l’Università della scienza e della tecnologia di Hong Kong (HKUST) attraverso la sovvenzione RPC10EG33.

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
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References

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Keywords: In Vivo ImagingTwo-photon FluorescenceStimulated Raman ScatteringMicroscopySubcellular ResolutionChemical SpecificityCellular MetabolismImmune ResponseNeurodegenerative DiseasesSpinal Cord InjuryTitanium Sapphire LaserOPOPhotodetectorOscilloscopeEOMPump LaserWavelengthOptical Alignment
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Citer Cet Article
Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
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