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Bio-ingénierie

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。

Abstract

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、固有の分子振動に基づいて、その天然微小環境における生体組織の標識のないイメージングを可能にし、したがって、細胞内分解能での生物学的プロセスの in vivo 研究のための完璧なツールを提供する。2光子励起蛍光(TPEF)イメージングをSRS顕微鏡に統合することにより、組織のデュアルモーダル in vivo イメージングは、細胞代謝、免疫応答、組織リモデリングなどに関与する動的プロセスを理解するのに役立つ、複数の視点から重要な生化学的および生物物理学的情報を取得できます。このビデオプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡システムのセットアップと、動物の脊髄の in vivo イメージング方法が導入されています。脊髄は、中枢神経系の一部として、脳と末梢神経系との間のコミュニケーションにおいて重要な役割を果たしている。リン脂質が豊富なミエリン鞘は、軸索を囲んで絶縁し、活動電位の塩分化伝導を可能にする。脊髄内のミエリン鞘の インビボ イメージングは、神経変性疾患および脊髄損傷の進行を研究するために重要である。このプロトコルはまた、高解像度の生物学的画像を取得するための動物調製および インビボ TPEF-SRSイメージング法についても記載しています。

Introduction

ラマン顕微鏡1,2は、生体分子中の様々な化学結合の特徴的な周波数に基づいて生体組織を画像化する強力な標識フリー法として浮上している。ラマン顕微鏡は、その非侵襲的で適応性の高いイメージング能力により、ミエリン鞘3,4,5、脂肪細胞6,7、および脂肪滴8,9,10などの生物学的組織における脂質富化成分のイメージングに広く使用されています。.誘導ラマンゲイン(SRG)または刺激ラマン損失(SRL)として取得された誘導ラマン散乱(SRS)信号はバックグラウンドフリーであり、自発的なラマン散乱と完全にスペクトル的に類似している11、12。さらに、SRLおよびSRGは分析物濃度に直線的に依存し、生化学成分の定量分析を可能にする9、11、13。二光子励起蛍光顕微鏡(TPEF)は、その固有の光学切片化能力、深い浸透深さ、および低い光毒性のために、in vivo生物学的イメージングに広く使用されてきました14,15,16。しかし、TPEFイメージングの性能は蛍光タグの特性に依存し、広帯域蛍光スペクトル8、17、18、19のために解決可能な色の数が制限されています。ラベルフリーSRSイメージングと蛍光ベースのTPEFイメージングは、2つの相補的なイメージングモダリティであり、それらの組み合わせは、組織の豊富な生物物理学的および生化学的情報を提供することができます。これら2つのイメージングモダリティは、どちらも非線形光学(NLO)プロセスに基づいており、1つの顕微鏡システムに簡単に統合できます。SRSイメージングとTPEFイメージングの組み合わせ、いわゆるデュアルモーダルイメージングは、細胞や組織の高次元イメージングとプロファイリングを可能にし、複雑な生物学的システムの包括的な理解を容易にします。具体的には、ピコ秒(ps)SRS顕微鏡は、フェムト秒(fs)SRS技術11と比較して高いスペクトル分解能で化学結合イメージングを達成することができ、生体組織、特に混雑した指紋領域20,21における複数の生化学的成分を区別することを可能にする。さらに、コヒーレントアンチストークス散乱(CARS)顕微鏡を統合した別の一般的に使用されるデュアルモーダルNLO顕微鏡システムと比較して、SRSはスペクトルおよび画像解釈、および検出感度の点でCARSよりも優れた性能を示しています11。SRS-TPEF顕微鏡は、カエノラブディティス・エレガンス9,22、アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシ脳5、マウス脳23,24、脊髄25,26、末梢神経27、脂肪組織7など、さまざまな生物系を研究するための強力なツールとして使用されてきました。

脊髄は脳とともに中枢神経系(CNS)を構成しています。生理学的および病理学的条件下でのCNSのインビボでの細胞活動を視覚化することは、CNS障害のメカニズムを理解し28,29,30および対応する治療法を開発するために重要である31,32,33。高速活動電位伝導のために軸索を包み込み、絶縁するミエリン鞘は、CNSの発達において重要な役割を果たしている。脱髄は、多発性硬化症などの白質障害の特徴として考えられています34。さらに、脊髄損傷後35、ミエリン破片はマクロファージの活性化を調節し、慢性炎症および二次損傷に寄与する36。したがって、生きたマウスモデルにおけるニューロンおよびグリア細胞と共にミエリン鞘のインビボイメージングは、CNS障害における動的プロセスを理解するのに非常に役立つ。

このプロトコルでは、自家製のTPEF-SRS顕微鏡の基本的なセットアップ手順を説明し、マウス脊髄のデュアルモーダル in vivo イメージング方法を紹介します。

Protocol

この作業で実施されるすべての動物処置は、香港科技大学(HKUST)の実験動物施設のガイドラインに従って行われ、HKUSTの動物倫理委員会によって承認されています。TPEF-SRS顕微鏡のセットアップと操作には、レーザーハンドリングの安全トレーニングが必要です。レーザーを扱うときは、常に適切な波長範囲のレーザー安全ゴーグルを着用してください。 1. TPEF-SRS顕微?…

Representative Results

脊髄軸索およびミエリン鞘のインビボデュアルモーダルイメージングは、後根神経節求心性ニューロンでEYFPを発現するThy1-YFPHトランスジェニックマウスを用いて実施される(図3)。これらの標識された求心性ニューロンは、末梢神経から脊髄に感覚情報を中継し、中央枝は脊髄背柱に位置する。TPEF-SRS顕微鏡では、ラベルフリーSRSイメージングにより密集分布ミエ?…

Discussion

このプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡の基本的なセットアップが詳細に説明されています。SRSイメージングの場合、ポンプビームとストークスビームはOPO内で時間的および空間的に重なり合っています。しかしながら、この重なりは、顕微鏡システムを通過した後に破壊され得る。したがって、ポンプビームとストークスビームの共局在化の空間的および時間的最適化の両方が、最適なSRSイメ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、香港研究助成金評議会の助成金16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19、イノベーション技術委員会(ITCPD/17-9)、大学助成金委員会のエリア・オブ・エクセレンス・スキーム(AoE/M-604/16、AOE/M-09/12)、香港科技大学(HKUST)の助成金RPC10EG33を通じて支援を受けました。

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
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References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

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Citer Cet Article
Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
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