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Bio-ingénierie

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

Abstract

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite a imagem livre de rótulos dos tecidos biológicos em seu microambiente natural com base na vibração molecular intrínseca, fornecendo assim uma ferramenta perfeita para o estudo in vivo de processos biológicos em resolução subcelular. Ao integrar a fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) no microscópio SRS, a imagem em si de tecidos pode adquirir informações bioquímicas e biofísicas críticas de múltiplas perspectivas que ajudam a entender os processos dinâmicos envolvidos no metabolismo celular, resposta imune e remodelagem tecidual, etc. Neste protocolo de vídeo, é introduzida a configuração de um sistema de microscópio TPEF-SRS, bem como o método de imagem in vivo da medula espinhal animal. A medula espinhal, como parte do sistema nervoso central, desempenha um papel crítico na comunicação entre o cérebro e o sistema nervoso periférico. A baia de mielina, abundante em fosfolipídios, circunda e isola o axônio para permitir a condução saltatória de potenciais de ação. A imagem in vivo de baias de mielina na medula espinhal é importante para estudar a progressão de doenças neurodegenerativas e lesão medular. O protocolo também descreve a preparação animal e métodos de imagem in vivo TPEF-SRS para adquirir imagens biológicas de alta resolução.

Introduction

A microscopia raman1,2 está emergindo como um poderoso método livre de rótulos para imagem de tecidos biológicos com base nas frequências características de várias ligações químicas em biomoléculas. Devido à sua capacidade de imagem não invasiva e bem adaptativa, a microscopia de Raman tem sido amplamente utilizada para imagens de componentes enriquecidos com lipídios em tecidos biológicos como a bainha de mielina3,4,5, adipócitos6,7, e gotículas lipídicas8,9,10 . O sinal de dispersão de Raman estimulado (SRS) adquirido como ganho de Raman estimulado (SRG) ou perda de Raman estimulado (SRL) é livre de fundo, mostrando perfeita semelhança espectral com Raman espontâneo espalhando11,12. Além disso, o SRL e o SRG dependem linearmente da concentração de analitos, permitindo a análise quantitativa dos componentes bioquímicos9,11,13. A microscopia de fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) tem sido amplamente utilizada para imagens biológicas in vivo devido à sua capacidade de seção óptica inerente, profundidade de penetração profunda e baixa fototoxicidade14,15,16. No entanto, o desempenho da imagem TPEF depende das características das tags fluorescentes, e o número de cores solucionáveis é limitado devido ao espectro de fluorescência de banda larga8,17,18,19. A imagem TPEF baseada em imagens TPEF baseadas em ressonância magnética e fluorescência sem rótulos são duas modalidades de imagem complementares, e sua combinação pode fornecer informações biofísicas e bioquímicas abundantes dos tecidos. Essas duas modalidades de imagem são baseadas nos processos ópticos não lineares (NLO), o que permite uma integração simples em um sistema de microscópio. A combinação da imagem SRS e TPEF, a chamada imagem dual-modal, permite imagens de alta dimensão e perfil de células e tecidos, facilitando uma compreensão abrangente de sistemas biológicos complexos. Especificamente, a microscopia SRS picosecond (ps) pode alcançar imagens de ligação química com alta resolução espectral em comparação com a técnica srs femtosegundo (fs)11, permitindo diferenciar múltiplos componentes bioquímicos em tecido biológico, especialmente na região de impressão digital lotada20,21. Além disso, em comparação com outro sistema de microscópio NLO dual-modal comumente usado com integração do microscópio de dispersão anti-Stokes coerente (CARS), o SRS mostra desempenho superior aos CARS em termos de interpretação espectral e de imagem, bem como sensibilidade de detecção11. O microscópio SRS-TPEF tem sido usado como uma poderosa ferramenta para estudar vários sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cérebro de rato23,24, medula espinhal25,26, nervo periférico27, e tecido adiepos7, etc.

A medula espinhal juntamente com o cérebro compõe o sistema nervoso central (SNC). Visualizar atividades celulares no IN VIVO em condições fisiológicas e patológicas é fundamental para a compreensão dos mecanismos dos transtornos do CNS28,29,30 e para o desenvolvimento de terapias correspondentes31,32,33. A baia de mielina, que envolve e isola axônios para condução potencial de ação de alta velocidade, desempenha um papel significativo no desenvolvimento do CNS. A demyelination é considerada uma marca registrada em distúrbios da matéria branca, como a esclerose múltipla34. Além disso, após lesão na medula espinhal35, os detritos de mielina podem modular a ativação do macrófago, contribuindo para inflamação crônica e lesões secundárias36. Portanto, a imagem in vivo da baialina de mielina juntamente com neurônios e células gliais em modelos de camundongos vivos é de grande ajuda para entender os processos dinâmicos nos distúrbios do CNS.

Neste protocolo, são descritos os procedimentos fundamentais de configuração de um microscópio TPEF-SRS construído em casa e introduzidos os métodos de imagem in vivo dual-modal para medula espinhal do rato.

Protocol

Todos os procedimentos animais realizados neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes do Laboratório de Instalações Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST) e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do HKUST. O treinamento de segurança para manuseio a laser é necessário para configurar e operar o microscópio TPEF-SRS. Use sempre óculos de segurança a laser com alcance de comprimento de onda apropriado ao lidar com laser. 1. Configuraç…

Representative Results

A imagem dual-modal in vivo de axônios espinhais, bem como baiatas de mielina é conduzida usando os camundongos transgênicos Thy1-YFPH, que expressam EYFP em neurônios aferentes neurônios aferentes de gânglios de raiz dorsal (Figura 3). Estes neurônios rotulados retransmitem as informações sensoriais do nervo periférico para a medula espinhal, com o ramo central localizado na coluna dorsal da medula espinhal. Com o microscópio TPEF-SRS, a baátima de mielina densamente di…

Discussion

Neste protocolo, a configuração básica do microscópio TPEF-SRS é descrita em detalhes. Para a imagem srs, os feixes de bomba e Stokes são temporalmente e espacialmente sobrepostos dentro do OPO. No entanto, essa sobreposição pode ser interrompida após passar pelo sistema de microscópio. Portanto, tanto a otimização espacial quanto temporal da colocalização das vigas da bomba e dos feixes de Stokes é necessária e fundamental para alcançar a imagem ótima do SRS. O atraso temporal entre a bomba e o feixe …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong através de subsídios 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, a Comissão de Inovação e Tecnologia (ITCPD/17-9), a Área de Excelência do Comitê de Subsídios Universitários (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) e a Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong (HKUST) através da concessão RPC10EG33.

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
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References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

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Citer Cet Article
Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
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