Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi möjliggör etikettfri avbildning av biomolekyler baserat på deras inneboende vibrationer av specifika kemiska bindningar. I detta protokoll beskrivs den instrumentella installationen av en integrerad SRS och två-foton fluorescensmikroskop för att visualisera cellulära strukturer i ryggmärgen hos levande möss.
Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi möjliggör etikettfri avbildning av de biologiska vävnaderna i dess naturliga mikromiljö baserad på inneboende molekylär vibration, vilket ger ett perfekt verktyg för in vivo-studier av biologiska processer vid subcellulär upplösning. Genom att integrera TPEF-avbildning (Two-photon excited fluorescence) i SRS-mikroskopet kan dubbelmodal in vivo-avbildning av vävnader förvärva kritisk biokemisk och biofysisk information från flera perspektiv som hjälper till att förstå de dynamiska processerna som är involverade i cellulär metabolism, immunsvar och vävnadsrenovering etc. I detta videoprotokoll introduceras installationen av ett TPEF-SRS-mikroskopsystem samt in vivo-avbildningsmetoden för djurets ryggmärg. Ryggmärgen, som en del av centrala nervsystemet, spelar en avgörande roll i kommunikationen mellan hjärnan och det perifera nervsystemet. Myelin mantel, riklig i fosfolipider, omger och isolerar axon för att tillåta salt ledning av handlingspotentialer. In vivo imaging av myelmantlar i ryggmärgen är viktigt för att studera utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar och ryggmärgsskada. Protokollet beskriver också djurpreparat och in vivo TPEF-SRS-avbildningsmetoder för att förvärva högupplösta biologiska bilder.
Raman mikroskopi1,2 växer fram som en kraftfull etikettfri metod för att avbilda biologiska vävnader baserat på de karakteristiska frekvenserna av olika kemiska bindningar i biomolekyler. På grund av sin icke-invasiva och välanpassade avbildningsförmåga har Raman-mikroskopi använts i stor utsträckning för att avbilda lipidberikade komponenter i biologiska vävnader som myelslida3,4,5, adipocyter6,7 och lipiddroppar8,9,10 . Stimulerad Raman spridning (SRS) signal förvärvas som stimulerad Raman vinst (SRG) eller stimulerad Raman förlust (SRL) är bakgrundsfri, visar perfekt spektral likhet med spontan Raman spridning11,12. Dessutom är SRL och SRG linjärt beroende av analytkoncentrationen, vilket möjliggör kvantitativ analys av biokemiska komponenter9,11,13. Två-foton upphetsad fluorescensmikroskopi (TPEF) har använts i stor utsträckning för in vivo biologisk avbildning på grund av dess inneboende optiska sektionsförmåga, djupa penetrationsdjup och låg fototoxicitet14,15,16. Prestandan hos TPEF-avbildning beror dock på egenskaperna hos fluorescerande taggar, och antalet lösta färger är begränsat på grund av bredbandsfluorescensspektra8,17,18,19. Label-free SRS imaging och fluorescence-baserade TPEF imaging är två kompletterande bildframställning modaliteter, och deras kombination kan ge riklig biofysisk och biokemisk information om vävnader. Dessa två bildframställningsmetoder är båda baserade på de icke-linjära optiska (NLO) processerna, vilket möjliggör enkel integration i ett mikroskopsystem. Kombinationen av SRS- och TPEF-avbildning, den så kallade dubbelmodala avbildningen, möjliggör högdimensionell avbildning och profilering av celler och vävnader, vilket underlättar en omfattande förståelse av komplexa biologiska system. Specifikt kan picosekund (ps) SRS-mikroskopi uppnå kemisk bondavbildning med hög spektralupplösning jämfört med femtosekund (fs) SRS-teknik11, vilket gör det möjligt att skilja flera biokemiska komponenter i biologisk vävnad, särskilt i den trånga fingeravtrycksregionen20,21. Jämfört med ett annat vanligt dubbelmodalt NLO-mikroskopsystem med integrering av sammanhängande anti-Stokes-spridningsmikroskop (CARS), visar SRS dessutom överlägsen prestanda för CARS när det gäller spektral- och bildtolkning samt detekteringskänslighet11. SRS-TPEF mikroskopet har använts som ett kraftfullt verktyg för att studera olika biologiska system, såsom Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, mushjärna23,24, ryggmärg25,26, perifer nerv27 och fettvävnad7, etc.
Ryggmärgen tillsammans med hjärnan utgör centrala nervsystemet (CNS). Visualisering av cellulära aktiviteter i CNS in vivo under fysiologiska och patologiska förhållanden är avgörande för att förstå mekanismerna för CNS störningar28,29,30 och för att utveckla motsvarande terapier31,32,33. Myelin-mantel, som lindar in och isolerar axoner för höghastighetsverkanspotentialledning, spelar en viktig roll i utvecklingen av CNS. Demyelination anses vara ett kännetecken i vit fråga störningar, såsom multipel skleros34. Dessutom, efter ryggmärgsskada35, myelin skräp kan modulera makrofag aktivering, bidra till kronisk inflammation och sekundär skada36. Därför är in vivo imaging av myelisk mantel tillsammans med nervceller och gliaceller i levande musmodeller till stor hjälp för att förstå de dynamiska processerna i CNS störningar.
I detta protokoll beskrivs de grundläggande installationsförfarandena för ett hembyggt TPEF-SRS-mikroskop och de dubbla modala in vivo-avbildningsmetoderna för mus ryggmärg introduceras.
I det här protokollet beskrivs den grundläggande inställningen av TPEF-SRS-mikroskopet i detalj. För SRS-avbildning överlappas pump- och Stokesstrålarna tidsmässigt och rumsligt inuti OPO. Denna överlappning kan dock störas efter att ha passerat genom mikroskopsystemet. Därför är både rumslig och tidsmässig optimering av colocalization av pumpen och Stokes strålar nödvändigt och avgörande för att uppnå optimal SRS-avbildning. Den tidsmässiga fördröjningen mellan pumpen och Stokes-strålen är rela…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Hong Kong Research Grants Council genom bidrag 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), området för excellensprogram för university grants committee (AoE/M-604/16, AOE/M-16)
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |