Her presenterer vi en enkel protokoll for ikke-invasiv genetisk prøvetaking av sommerfuglpopulasjoner basert på feltinnsamling av gjenværende eggrester. Den kan brukes til å bekrefte artsidentitet og kvantifisere genetisk variasjon. Denne protokollen kan enkelt tilpasses bredere grupper for samfunnsvitenskapelig engasjement.
Globale insektnedganger fortsetter å akselerere. Effektiv genetisk prøvetaking er kritisk nødvendig for å fremme forståelsen av mange taxa og adressere eksisterende kunnskapshull. Denne protokollen representerer en demonstrert metode for ikke-destruktiv prøvetaking av sjeldne sommerfugler for populasjonsgenetisk struktur eller DNA-strekkodingsanalyser. Den bruker korionen av klekket sommerfuglovae for å gi tilstrekkelig høy mengde og kvalitets-DNA for vellykket gensekvensering for å bekrefte artsidentitet og kvantifisere genetisk variasjon. Det kan være spesielt nyttig når andre vevsprøvetakingsteknikker er upraktiske eller utilgjengelige. Selv om den er utviklet for en lepidopteran, kan den likevel lett tilpasses for bruk med andre insektarter. Den ble spesielt designet med brukervennlighet som et mål å bidra til å maksimere bred implementering av personer med varierende erfaring og ferdighetsnivå, for eksempel samfunnsforskere, bevaringsutøvere og studenter, og for bruk over store geografiske områder for å lette bred befolkningsprøvetaking. Dataene som genereres kan bidra til å informere taksonomiske og noteringsbeslutninger, bevarings- og forvaltningshandlinger og forbedre grunnleggende økologisk forskning.
Effektiv populasjonsgenetisk prøvetaking av sjeldne, synkende og / eller oppførte insektskatta er ofte kritisk for å bidra til å informere bevarings- og forvaltningshandlinger. Dødelige eller skadelige vevsprøvetakingsmetoder brukes rutinemessig for mange genetiske analyser. Disse metodene er imidlertid uønskede eller ikke tillatt fordi de kan forårsake skade på sårbare eksisterende populasjoner eller påvirke atferd og kondisjon negativt. Ulike ikke-dødelige eller ikke-invasive prøvetakingsteknikker som involverer vev som hele ben, antenne- eller vingeklipp, larveeksuviae eller hemolymfe fra defensive sekreter og andre produkter, som frass, har vært egnet for insektgenetisk forskning 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Den generelle gjennomførbarheten og anvendeligheten av disse forskjellige vevsprøvetakingsteknikkene varierer betydelig basert på biologi, økologi, oppførsel, størrelse og sjeldenhet av fokalorganismen, situasjonen og individene som samler materialet. For eksempel krever hele ben eller appendage klipping midlertidig fangst og forsiktig håndtering av flere personer i et passende livsstadium, vanligvis av erfarent personell. På samme måte vil vevskilder, som larve exuviae eller frass, sannsynligvis bare være praktiske hvis organismene er i fangenskap eller midlertidig holdt i en tilstrekkelig periode.
For forskningsspørsmål som stilles på befolkningsnivå, for eksempel spørsmål om potensiell taksonomisk differensiering eller genetisk struktur, er det ofte nødvendig med prøvetaking på bredere tidsmessig eller geografisk skala (dvs. regional eller kontinental). Som et resultat kan visse ikke-invasive vevskilder være helt upraktiske eller i det minste ineffektive å samle i mengde. Prøvetaking på slike skalaer kan i tillegg være logistisk eller økonomisk upraktisk eller uoverkommelig for enkeltforskere eller enda mindre feltteam å gjennomføre. Mens direkte engasjement fra samfunnsforskere i økende grad har blitt vedtatt av forskningsmiljøet for å bidra til å løse mange av disse utfordringene og akselerere stor datadrevet innsamling, har adopsjon vært begrenset for studier som involverer ikke-destruktiv, ikke-invasiv eller eDNA-prøvetaking10,11,12.
For å bidra til å overvinne noen av disse potensielle begrensningene, viste vi at korionen fra klekket sommerfuglovae kunne gi tilstrekkelig høy mengde og kvalitets-DNA for vellykket gensekvensering for å bekrefte artsidentitet og kvantifisere genetisk variasjon. Vi testet deretter ulike innsamlingsprotokoller ved hjelp av denne teknikken13. Dette pilotarbeidet tjente som grunnlag for videre metodisk forbedring. Dette papiret beskriver i detalj den resulterende enkle, men omfattende reviderte feltsamlingsprotokollen som ble rullet ut for samfunnsforskere og annet ikke-ekspertpersonell. Denne protokollen er en del av en populasjonsstrukturanalyse av den frostede elfinsommerfuglen (Callophrys irus) for å bidra til å informere fremtidige bevaringsaksjoner og en føderal bestemmelse av muligens notering i henhold til US Endangered Species Act. Selv om det potensielt er mer arbeidskrevende enn noen ikke-invasive metoder, gjør mangelen på nødvendig organismekontakt og brukervennlighet det til en potensielt levedyktig modell som kan brukes på andre populasjonsgenetiske forskningsprogrammer rettet mot et utvalg av både vanlige insekter og bevaringsproblemer, som etterlater gjenværende eggrester fra nylig klekkede nymfer eller larver. Protokollspråket som presenteres her ble spesielt utviklet for sommerfugler i familien Lycaenidae og for bruk av ikke-eksperter definert her som samfunnsforskere eller andre individer (f.eks. Byråbiologer, praktikanter) med begrenset entomologisk erfaring.
Denne protokollen beskriver en feltmetode for ikke-destruktiv prøvetaking av sjeldne sommerfugler for populasjonsgenetisk struktur eller DNA-strekkodingsanalyser. De generelle fordelene med denne protokollen er spesielt utviklet for å bidra til å maksimere bred implementering av personer med varierende erfaring og ferdighetsnivå som samfunnsforskere, bevaringsutøvere og studenter. Disse inkluderer relativt lave totalkostnader, forsyninger og utstyr som er enkle å anskaffe, en enkel og tilgjengelig metode uten mange altfor komplekse trinn, og enkel distribusjon over et bredt geografisk område. Det retter seg i tillegg mot gjenværende organisk materiale som eliminerer behovet for midlertidig å fange eller manipulere, og i prosessen potensielt skade levende organismer for å skaffe genetiske prøver. Videre utvider det den potensielle perioden som er tilgjengelig for prøveinnsamling utover den tradisjonelle fenologien eller levetiden til et bestemt livsstadium, og forbedrer fleksibiliteten og den generelle innsamlingsmuligheten for å maksimere utvalgstallene.
Mens fokustaksonet for denne innsatsen var den frostede elfinsommerfuglen, en utbredt, men avtagende habitatspesialist, kan denne protokollen brukes bredere på mange andre insekter, inkludert de av bevaringsbekymring. På samme måte, mens protokollen retter seg mot innsamling av klekkede egg som kilde til genetisk materiale, kan den lett tilpasses andre, potensielt mer tradisjonelle prøver (f.eks. Ben, vingefragmenter, antenneklemmer) eller til og med hele organismer. Dette aspektet er imidlertid også en potensiell begrensning av protokollen. Selv om de aller fleste trinnene er designet for å være relativt enkle og raske å oppnå, er det tids- og arbeidskrevende å søke flekker av larvevertsplanter for klekkeegg, som hver for seg vanligvis er <1,0 mm i diameter. Ikke desto mindre er en så omfattende prøvetakingsaktivitet spesielt ideell for et større nettverk av deltakere som samfunnsforskere.
Som med andre feltbaserte prosjekter er det viktig med nøye forberedelser. Dette inkluderer å gjennomføre en full oversikt over forsyningene som trengs for å sikre at ingen varer mangler, alt nødvendig forberedelsesarbeid er fullført, og de er godt organisert, sikkert pakket og klare for feltdistribusjon. I tillegg bør alt feltpersonell, spesielt de som utfører vevsinnsamlingen, gjennomgå innsamlingsprotokollen i detalj før en innsamlingshendelse og ta opp eventuelle spørsmål til enkeltpersoner som fører tilsyn med prosjektet. Når du er i feltet, krever prøveinnsamlingsdelen av protokollen nøye oppmerksomhet på detaljer. Dette inkluderer å lokalisere og nøye inspisere eventuelle ovae for å sikre at de klekkes ut og dermed er egnet for oppsamling, grundig rengjøring av tang, utskifting av hansker for å redusere vevsoverføring mellom prøvetakingshendelser, og sikre at vevsprøver er helt nedsenket i lysisbuffer innenfor hvert 1,5 ml mikrosentrifugerør. Til slutt er det viktig å registrere nøyaktige og detaljerte data, som inkluderer kobling av den unike ID-etiketten som er tildelt fra mikrosentrifugerøret sammen med den spesifikke prøven som er tatt og all annen relevant innsamlingsinformasjon. Selv om dette trinnet er rutine i vitenskapelig forskning, må det ofte avklares grundig og forsterkes for et samfunnsvitenskapelig publikum.
Her demonstrerer vi potensiell utnyttelse av samfunnsforskere for ikke-dødelig prøveinnsamling fra små, sjeldne og truede arter. Det er imidlertid noen potensielle begrensninger å huske på når du analyserer eventuelle resulterende genetiske data. For eksempel, mens samling av prøver fra en enkelt øker sjansene for å gjenopprette nok DNA for deteksjon, introduserer det også potensielt heterozygositet. I tillegg, da protokollen innebærer å samle chorionen fra klekket ovae, kan bare kvinnelige sommerfugler, som representerer foreldrenes DNA, prøves i en populasjon. Likevel, da ingen tidligere genetiske data på populasjonsnivå var tilgjengelige for C. irus, kan den resulterende innsikten bare være til nytte for bevaring og forvaltning av arter. For eksempel, mens en grundig, detaljert studiedesign og nøye markørvalg vil være nødvendig for å tilstrekkelig vurdere populasjonsstrukturen, kan prøvetakingsprotokollen som er skissert her og bruken av cytokrom c oksidase underenhet 1 (CO1) DNA-strekkoding brukes til å oppdage forekomsten av sjeldne eller truede taxa. Ytterligere diskusjon av nytten og anvendelsen av DNA-sekvensering fra ikke-dødelig prøvetaking beskrevet her er detaljert av Storer et. al.14.
Utover det primære målet om å samle prøver for genetisk analyse, legger protokollen også vekt på at deltakerne tar detaljerte digitale fotografier av alle feltsteder, samlingssteder, larvevertsplanter som er tilstede og andre elementer i det omkringliggende habitatet som kan være relevante. Slik dokumentasjon bidrar til å gi en generell habitatvurdering som er nyttig for å illustrere eksisterende stedsforhold som plantefenologi, vertsressurstetthet og forvaltningshistorie (f.eks. Nylig foreskrevet brann). Slik informasjon er spesielt nyttig for prosjekter der feltprøver tas over en lengre tidsperiode for å muliggjøre mer detaljerte miljøsammenligninger.
Til slutt, ettersom den globale insektnedgangen fortsetter å akselerere, er det kritisk behov for utvidet artsvurdering og overvåkingsinnsats15,16. Bruken av mer utbredt deltakende engasjement fra samfunnsforskere, studenter (f.eks. US Fish and Wildlife Service praktikanter og stipendiater) og bevaringsutøvere tilbyr stadig mer levedyktige alternativer for omfattende datainnsamling av mange typer, inkludert DNA-prøver. Følgelig har dataene som genereres fra denne protokollen mange mulige bruksområder. Disse inkluderer å bidra til å informere bevaringshandlinger (f.eks. Planlegging, gjenoppretting og forvaltning), noteringsbeslutninger eller artsstatusvurderinger, og økologisk, populasjons- og taksonomisk forskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge og Jessup Weichelt for hjelp med ulike aspekter av prosjektet, inkludert logistikk, koordinering, tillatelse og / eller prøveinnsamling. Denne forskningen ble finansiert gjennom et tilskudd fra US Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) administrert av Wildlife Management Institute (tilskudd SA 2021-01).
14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
packing material Amount per deployable unit: as needed |