En omfattende laboratorieprotokol og analysearbejdsgang er beskrevet for et hurtigt, omkostningseffektivt og ligetil kolorimetrisk cellebaseret assay til detektering af neutraliserende elementer mod AAV6.
Rekombinante adeno-associerede vira (rAAV) har vist sig at være en sikker og vellykket vektor til overførsel af genetisk materiale til behandling af forskellige sundhedsmæssige forhold i både laboratoriet og klinikken. Imidlertid udgør allerede eksisterende neutraliserende antistoffer (NAb’er) mod AAV-kapsider en løbende udfordring for den vellykkede administration af genterapier i både store dyreforsøgsmodeller og humane populationer. Foreløbig screening for værtsimmunitet mod AAV er nødvendig for at sikre effekten af AAV-baserede genterapier som både et forskningsværktøj og som et klinisk levedygtigt terapeutisk middel. Denne protokol beskriver et kolorimetrisk in vitro-assay til påvisning af neutraliserende faktorer mod AAV-serotype 6 (AAV6). Assayet udnytter reaktionen mellem en AAV, der koder for et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og dets substrat NBT / BCIP, som genererer en uopløselig kvantificerbar lilla plet ved kombination.
I denne protokol kombineres serumprøver med en AAV, der udtrykker AP og inkuberes for at tillade potentiel neutraliserende aktivitet at forekomme. Virusserumblanding tilsættes efterfølgende til celler for at muliggøre viral transduktion af eventuelle AAV’er, der ikke er blevet neutraliseret. NBT/BCIP-substratet tilsættes og gennemgår en kromogen reaktion svarende til viral transduktion og neutraliserende aktivitet. Andelen af farvet areal kvantificeres ved hjælp af et frit softwareværktøj til at generere neutraliserende titre. Dette assay viser en stærk positiv sammenhæng mellem farvning og viral koncentration. Vurdering af serumprøver fra får før og efter administration af en rekombinant AAV6 førte til en dramatisk stigning i neutraliserende aktivitet (125 til >10.000 gange stigning). Assayet viste tilstrækkelig følsomhed til at detektere neutraliserende aktivitet i >1:32.000 serumfortyndelser. Dette assay giver en enkel, hurtig og omkostningseffektiv metode til at detektere NAb’er mod AAV’er.
Adeno-associerede vira (AAV) anvendes i stigende grad som vektorer til levering af genterapier til forsøgsbehandlinger for forskellige sundhedsmæssige tilstande, der påvirker kardiovaskulære, lunge-, kredsløbs-, okulære og centralnervesystemer1,2,3,4,5. Populariteten af AAV-vektorer som en førende genterapiplatform stammer fra deres positive sikkerhedsprofil, langsigtede transgene ekspression og vidtrækkende vævsspecifikke tropismer1,6. Vellykkede resultater i dyreforsøg har banet vejen for over halvtreds kliniske forsøg med AAV-genterapi, der med succes har nået deres effektendepunkter7, samt frigivelsen af det første kommercielt tilgængelige AAV-genterapilægemiddel, der er godkendt af US Food and Drug Administration8. Efter de første succeser har AAV fortsat vundet indpas i grundforsknings- og klinisk forskningssektorerne som en valgfri vektor og er i øjeblikket den eneste in vivo-genterapi, der er godkendt til klinisk brug i USA og Europa9. Ikke desto mindre er tilstedeværelsen af allerede eksisterende neutraliserende antistoffer (NAb’er) mod AAV-vektorkapsider fortsat en hindring for både præklinisk forskning og effekten af kliniske forsøg. NAb’er er til stede i både naive humane og animalske populationer og hæmmer gentransduktion efter in vivo-administration af en AAV-vektor1. AAV-seropositivitet er et udelukkelseskriterium for de fleste genterapiforsøg, og derfor er foreløbig screening for værtsimmunitet afgørende i både laboratoriet og klinikken. Etablering af et assay, der kan detektere tilstedeværelsen af NAb’er mod AAV, er et vigtigt skridt i pipelinen for ethvert AAV-genterapibaseret forskningsprojekt. Denne rapport fokuserer på AAV6, som har været af interesse for forskere på grund af dens effektive og selektive transduktion i stribet muskel (hjerte- og skeletmuskulatur)1,10,11,12. Genterapi betragtes som en lovende strategi for at målrette mod hjertet, fordi det er svært at målrette specifikt mod hjertet uden invasive åbne hjerteprocedurer.
Neutraliserende aktivitet bestemmes normalt ved anvendelse af enten et cellebaseret in vitro– eller in vivo-transduktionshæmningsassay. In vivo NAb-assays involverer normalt administration af serum fra en forsøgsperson (f.eks. humant eller stort dyr) i mus, efterfulgt af en AAV med et reportergen efterfulgt af test for ekspression af reportergenet eller tilsvarende antigen. In vitro-assays bestemmer NAb-titre ved at inkubere serum eller plasma fra et humant eller stort dyr i serielle fortyndinger med en rekombinant AAV (rAAV), der udtrykker et reportergen. Celler inficeres med serum/virus-blandingen, og i hvilket omfang reportergenekspressionen hæmmes, vurderes i forhold til kontroller. In vitro-assays anvendes i vid udstrækning til NAb-screening på grund af deres forholdsvis lavere omkostninger, hurtighed i test og større kapacitet til standardisering og validering13,14 sammenlignet med in vivo-assays. In vivo-assays rapporteres ofte at have større følsomhed15,16, men den samme påstand er blevet fremsat vedrørende in vitro-assays14,17.
Hidtil har in vitro NAb-assays hovedsageligt brugt luminescens (luciferase) som reportergenet til at detektere neutralisering. Selvom en lysbaseret metode har fortjeneste i mange sammenhænge, kan et kolorimetrisk/kromogent NAb-assay være fordelagtigt under visse omstændigheder. Kolorimetriske assays til vurdering af neutralisering er blevet anvendt med succes for andre vira såsom influenza og adenovirus18,19. Deres tiltrækningskraft skyldes deres enkelhed, lavere omkostninger og kravet om kun daglige laboratorieapparater og værktøjer20. NAb-assays, der bruger et luminescensbaseret reportergen, kræver dyre substratsæt, et luminometer og tilsvarende software til analyse21. Dette kolorimetriske assay har den fordel, at det kun kræver et lysmikroskop og et meget billigt substrat. Rapportering af følsomheden af kolorimetriske versus selvlysende assays har givet modstridende resultater. En undersøgelse foreslog, at luminescensbaserede ELISA-assays viser større følsomhed og sammenlignelig reproducerbarhed med kolorimetriske assays22, mens en anden fandt kolorimetrisk-baserede ELISA-assays for at give større følsomhed23. Her tilvejebringes en detaljeret protokol for et in vitro NAb-assay mod AAV, der anvender den kromogene reaktion mellem et AAV-koder for et alkalisk phosphatase (AP) reportergen og et nitroblåt tetrazolium /5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (NBT / BCIP) substrat. Denne trinvise protokol blev udviklet på baggrund af en tidligere rapport, der anvendte et hPLAP (humant placental alkalisk phosphatase) reportergen (AAV6-hPLAP) til at detektere neutraliserende aktivitet mod AAV24. Dette assay er omkostningseffektivt, tidseffektivt, let at konfigurere og kræver minimale tekniske færdigheder, laboratorieudstyr og reagenser. Desuden giver enkelheden i dette assay det potentialet til at blive optimeret til brede anvendelser på tværs af forskellige typer celler, væv eller virale serotyper.
Denne rapport beskriver et kolorimetrisk assay, der vurderer omfanget af AAV-neutralisering i en given serumprøve ved at evaluere en kromogen reaktion svarende til graden af in vitro-viral transduktion. Udviklingen af protokollen var baseret på den kendte kromogene reaktion mellem enzymet alkalisk phosphatase og NBT/BCIP, som i vid udstrækning er blevet anvendt som et farvningsværktøj til påvisning af proteinmål i applikationer såsom immunhistokemi og som et reporterværktøj til evaluering af viral tran…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af et National Health and Medical Research Council Project Grant til JRM og CJT (ID 1163732) og delvist af den victorianske regerings Operational Infrastructure Support Program. SB støttes af et fælles Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW er støttet af The Shine On Foundation og et Future Leader Fellowship fra National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM støttes af et National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).
0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
Aluminium foil | |||
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
Cell and tissue culture safety cabinet | |||
Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Haemocytometer | |||
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
HT1080 cells | ATCC | ||
ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
Oven | For a 65 °C incubation | ||
Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | |||
Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
Water bath |