JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

En trinvis metode til at detektere neutraliserende antistoffer mod AAV ved hjælp af et kolorimetrisk cellebaseret assay

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63419
, , , , ,
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology,La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR),The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School,Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health,The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital,Monash University

Summary

En omfattende laboratorieprotokol og analysearbejdsgang er beskrevet for et hurtigt, omkostningseffektivt og ligetil kolorimetrisk cellebaseret assay til detektering af neutraliserende elementer mod AAV6.

Abstract

Rekombinante adeno-associerede vira (rAAV) har vist sig at være en sikker og vellykket vektor til overførsel af genetisk materiale til behandling af forskellige sundhedsmæssige forhold i både laboratoriet og klinikken. Imidlertid udgør allerede eksisterende neutraliserende antistoffer (NAb’er) mod AAV-kapsider en løbende udfordring for den vellykkede administration af genterapier i både store dyreforsøgsmodeller og humane populationer. Foreløbig screening for værtsimmunitet mod AAV er nødvendig for at sikre effekten af AAV-baserede genterapier som både et forskningsværktøj og som et klinisk levedygtigt terapeutisk middel. Denne protokol beskriver et kolorimetrisk in vitro-assay til påvisning af neutraliserende faktorer mod AAV-serotype 6 (AAV6). Assayet udnytter reaktionen mellem en AAV, der koder for et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og dets substrat NBT / BCIP, som genererer en uopløselig kvantificerbar lilla plet ved kombination.

I denne protokol kombineres serumprøver med en AAV, der udtrykker AP og inkuberes for at tillade potentiel neutraliserende aktivitet at forekomme. Virusserumblanding tilsættes efterfølgende til celler for at muliggøre viral transduktion af eventuelle AAV’er, der ikke er blevet neutraliseret. NBT/BCIP-substratet tilsættes og gennemgår en kromogen reaktion svarende til viral transduktion og neutraliserende aktivitet. Andelen af farvet areal kvantificeres ved hjælp af et frit softwareværktøj til at generere neutraliserende titre. Dette assay viser en stærk positiv sammenhæng mellem farvning og viral koncentration. Vurdering af serumprøver fra får før og efter administration af en rekombinant AAV6 førte til en dramatisk stigning i neutraliserende aktivitet (125 til >10.000 gange stigning). Assayet viste tilstrækkelig følsomhed til at detektere neutraliserende aktivitet i >1:32.000 serumfortyndelser. Dette assay giver en enkel, hurtig og omkostningseffektiv metode til at detektere NAb’er mod AAV’er.

Introduction

Adeno-associerede vira (AAV) anvendes i stigende grad som vektorer til levering af genterapier til forsøgsbehandlinger for forskellige sundhedsmæssige tilstande, der påvirker kardiovaskulære, lunge-, kredsløbs-, okulære og centralnervesystemer1,2,3,4,5. Populariteten af AAV-vektorer som en førende genterapiplatform stammer fra deres positive sikkerhedsprofil, langsigtede transgene ekspression og vidtrækkende vævsspecifikke tropismer1,6. Vellykkede resultater i dyreforsøg har banet vejen for over halvtreds kliniske forsøg med AAV-genterapi, der med succes har nået deres effektendepunkter7, samt frigivelsen af det første kommercielt tilgængelige AAV-genterapilægemiddel, der er godkendt af US Food and Drug Administration8. Efter de første succeser har AAV fortsat vundet indpas i grundforsknings- og klinisk forskningssektorerne som en valgfri vektor og er i øjeblikket den eneste in vivo-genterapi, der er godkendt til klinisk brug i USA og Europa9. Ikke desto mindre er tilstedeværelsen af allerede eksisterende neutraliserende antistoffer (NAb’er) mod AAV-vektorkapsider fortsat en hindring for både præklinisk forskning og effekten af kliniske forsøg. NAb’er er til stede i både naive humane og animalske populationer og hæmmer gentransduktion efter in vivo-administration af en AAV-vektor1. AAV-seropositivitet er et udelukkelseskriterium for de fleste genterapiforsøg, og derfor er foreløbig screening for værtsimmunitet afgørende i både laboratoriet og klinikken. Etablering af et assay, der kan detektere tilstedeværelsen af NAb’er mod AAV, er et vigtigt skridt i pipelinen for ethvert AAV-genterapibaseret forskningsprojekt. Denne rapport fokuserer på AAV6, som har været af interesse for forskere på grund af dens effektive og selektive transduktion i stribet muskel (hjerte- og skeletmuskulatur)1,10,11,12. Genterapi betragtes som en lovende strategi for at målrette mod hjertet, fordi det er svært at målrette specifikt mod hjertet uden invasive åbne hjerteprocedurer.

Neutraliserende aktivitet bestemmes normalt ved anvendelse af enten et cellebaseret in vitro– eller in vivo-transduktionshæmningsassay. In vivo NAb-assays involverer normalt administration af serum fra en forsøgsperson (f.eks. humant eller stort dyr) i mus, efterfulgt af en AAV med et reportergen efterfulgt af test for ekspression af reportergenet eller tilsvarende antigen. In vitro-assays bestemmer NAb-titre ved at inkubere serum eller plasma fra et humant eller stort dyr i serielle fortyndinger med en rekombinant AAV (rAAV), der udtrykker et reportergen. Celler inficeres med serum/virus-blandingen, og i hvilket omfang reportergenekspressionen hæmmes, vurderes i forhold til kontroller. In vitro-assays anvendes i vid udstrækning til NAb-screening på grund af deres forholdsvis lavere omkostninger, hurtighed i test og større kapacitet til standardisering og validering13,14 sammenlignet med in vivo-assays. In vivo-assays rapporteres ofte at have større følsomhed15,16, men den samme påstand er blevet fremsat vedrørende in vitro-assays14,17.

Hidtil har in vitro NAb-assays hovedsageligt brugt luminescens (luciferase) som reportergenet til at detektere neutralisering. Selvom en lysbaseret metode har fortjeneste i mange sammenhænge, kan et kolorimetrisk/kromogent NAb-assay være fordelagtigt under visse omstændigheder. Kolorimetriske assays til vurdering af neutralisering er blevet anvendt med succes for andre vira såsom influenza og adenovirus18,19. Deres tiltrækningskraft skyldes deres enkelhed, lavere omkostninger og kravet om kun daglige laboratorieapparater og værktøjer20. NAb-assays, der bruger et luminescensbaseret reportergen, kræver dyre substratsæt, et luminometer og tilsvarende software til analyse21. Dette kolorimetriske assay har den fordel, at det kun kræver et lysmikroskop og et meget billigt substrat. Rapportering af følsomheden af kolorimetriske versus selvlysende assays har givet modstridende resultater. En undersøgelse foreslog, at luminescensbaserede ELISA-assays viser større følsomhed og sammenlignelig reproducerbarhed med kolorimetriske assays22, mens en anden fandt kolorimetrisk-baserede ELISA-assays for at give større følsomhed23. Her tilvejebringes en detaljeret protokol for et in vitro NAb-assay mod AAV, der anvender den kromogene reaktion mellem et AAV-koder for et alkalisk phosphatase (AP) reportergen og et nitroblåt tetrazolium /5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (NBT / BCIP) substrat. Denne trinvise protokol blev udviklet på baggrund af en tidligere rapport, der anvendte et hPLAP (humant placental alkalisk phosphatase) reportergen (AAV6-hPLAP) til at detektere neutraliserende aktivitet mod AAV24. Dette assay er omkostningseffektivt, tidseffektivt, let at konfigurere og kræver minimale tekniske færdigheder, laboratorieudstyr og reagenser. Desuden giver enkelheden i dette assay det potentialet til at blive optimeret til brede anvendelser på tværs af forskellige typer celler, væv eller virale serotyper.

Protocol

Alle aspekter af dyrepleje og eksperimenter blev udført efter Florey Institute of Neuroscience and Mental Health retningslinjer og den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål efter Reference25. 1,5-3-årige Merino-moderfår blev brugt til undersøgelsen. En skematisk oversigt over assayprotokollen findes i figur 1. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/…

Representative Results

Transduktionsassay for at etablere den optimale virale dosering til pladedækningHT1080-celler, en veletableret fibrosarkomcellelinje, blev udvalgt til dette assay. En koncentration på 1 x 104 HT1080 celler / brønd tilvejebragte ~ 50% cellesammenløb i hver brønd i en 96-brønds plade. For at bestemme den optimale virale koncentration for assayet blev en rAAV, der koder for et hPLAP (humant placental alkalisk phosphatase) reportergen (AAV6-hPLAP)31 , tilsat i tre…

Discussion

Denne rapport beskriver et kolorimetrisk assay, der vurderer omfanget af AAV-neutralisering i en given serumprøve ved at evaluere en kromogen reaktion svarende til graden af in vitro-viral transduktion. Udviklingen af protokollen var baseret på den kendte kromogene reaktion mellem enzymet alkalisk phosphatase og NBT/BCIP, som i vid udstrækning er blevet anvendt som et farvningsværktøj til påvisning af proteinmål i applikationer såsom immunhistokemi og som et reporterværktøj til evaluering af viral tran…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev finansieret af et National Health and Medical Research Council Project Grant til JRM og CJT (ID 1163732) og delvist af den victorianske regerings Operational Infrastructure Support Program. SB støttes af et fælles Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW er støttet af The Shine On Foundation og et Future Leader Fellowship fra National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM støttes af et National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. . Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003)
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3′,4′-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Tags

Neutralizing AntibodiesAAV Gene TherapyColorimetric Cell-based AssayHT1080 CellsSerum DilutionsViral GenomeParaformaldehydeAlkaline PhosphataseBCIP/NBTMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image