Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.
I virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) hanno dimostrato di essere un vettore sicuro e di successo per il trasferimento di materiale genetico per il trattamento di varie condizioni di salute sia in laboratorio che in clinica. Tuttavia, gli anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi AAV rappresentano una sfida continua per la somministrazione di successo delle terapie geniche sia in modelli sperimentali su grandi animali che in popolazioni umane. Lo screening preliminare per l’immunità dell’ospite contro l’AAV è necessario per garantire l’efficacia delle terapie geniche basate su AAV sia come strumento di ricerca che come agente terapeutico clinicamente valido. Questo protocollo descrive un test colorimetrico in vitro per rilevare fattori neutralizzanti contro il sierotipo 6 AAV (AAV6). Il test utilizza la reazione tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e il suo substrato NBT / BCIP, che genera una macchia viola quantificabile insolubile sulla combinazione.
In questo protocollo, i campioni di siero sono combinati con un AP che esprime AAV e incubati per consentire il verificarsi di una potenziale attività neutralizzante. La miscela di siero virale viene successivamente aggiunta alle cellule per consentire la trasduzione virale di eventuali AAV che non sono stati neutralizzati. Il substrato NBT/BCIP viene aggiunto e subisce una reazione cromogenica, corrispondente alla trasduzione virale e all’attività neutralizzante. La proporzione di area colorata viene quantificata utilizzando uno strumento software libero per generare titoli neutralizzanti. Questo test mostra una forte correlazione positiva tra colorazione e concentrazione virale. La valutazione di campioni di siero di pecora prima e dopo la somministrazione di un AAV6 ricombinante ha portato ad un drammatico aumento dell’attività neutralizzante (da 125 a >10.000 volte). Il test ha mostrato un’adeguata sensibilità per rilevare l’attività neutralizzante in >1:32.000 diluizioni sieriche. Questo test fornisce un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare nAbs contro AAV.
I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati come vettori per la somministrazione di terapie geniche a trattamenti sperimentali per varie condizioni di salute che hanno un impatto sul sistema cardiovascolare, polmonare, circolatorio, oculare e nervoso centrale1,2,3,4,5. La popolarità dei vettori AAV come piattaforma leader nella terapia genica deriva dal loro profilo di sicurezza positivo, dall’espressione transgenica a lungo termine e dai trofismi tessuto-specifici ad ampio raggio1,6. I risultati positivi negli studi sugli animali hanno spianato la strada a oltre cinquanta studi clinici di terapia genica AAV che hanno raggiunto con successo i loro endpoint di efficacia7, nonché al rilascio del primo farmaco per la terapia genica AAV disponibile in commercio approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti8. Dopo i successi iniziali, AAV ha continuato a guadagnare terreno nei settori della ricerca di base e clinica come vettore di scelta ed è attualmente l’unica terapia genica in vivo approvata per uso clinico negli Stati Uniti e in Europa9. Tuttavia, la presenza di anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi vettori AAV rimane un ostacolo sia alla ricerca preclinica che all’efficacia degli studi clinici. I NAb sono presenti sia in popolazioni naïve umane che animali e inibiscono la trasduzione genica a seguito della somministrazione in vivo di un vettore AAV1. La sieropositività AAV è un criterio di esclusione per la maggior parte degli studi di terapia genica e pertanto lo screening preliminare per l’immunità dell’ospite è cruciale sia in laboratorio che in clinica. Stabilire un test in grado di rilevare la presenza di NAbs contro AAV è un passo essenziale nella pipeline di qualsiasi progetto di ricerca basato sulla terapia genica AAV. Questo rapporto si concentra su AAV6 che è stato di interesse per i ricercatori grazie alla sua trasduzione efficiente e selettiva nel muscolo striato (cuore e muscolo scheletrico)1,10,11,12. La terapia genica è considerata una strategia promettente per il targeting del cuore perché è difficile indirizzare specificamente il cuore senza procedure invasive a cuore aperto.
L’attività neutralizzante viene solitamente determinata utilizzando un test di inibizione della trasduzione in vitro o in vivo basato su cellule. In vivo I saggi NAb di solito comportano la somministrazione di siero da un soggetto del test (ad esempio, umano o animale di grandi dimensioni) nei topi, seguito da un AAV con un gene reporter, seguito da test per l’espressione del gene reporter o dell’antigene corrispondente. I saggi in vitro determinano i titoli di NAb incubando siero o plasma da un essere umano o da un grande animale in diluizioni seriali con un AAV ricombinante (rAAV) che esprime un gene reporter. Le cellule sono infettate dalla miscela siero/virus e la misura in cui l’espressione genica reporter è inibita viene valutata rispetto ai controlli. I saggi in vitro sono ampiamente utilizzati per lo screening NAb a causa del loro costo relativamente inferiore, della rapidità nei test e della maggiore capacità di standardizzazione e convalida13,14 rispetto ai saggi in vivo. I saggi in vivo sono spesso segnalati per avere una maggiore sensibilità15,16, ma la stessa affermazione è stata fatta per quanto riguarda i saggi de vitro14,17.
Ad oggi, i saggi NAb in vitro hanno utilizzato principalmente la luminescenza (luciferasi) come gene reporter per rilevare la neutralizzazione. Sebbene un metodo basato sulla luce abbia meriti in molti contesti, un test NAb colorimetrico / cromogenico può essere vantaggioso in alcune circostanze. Saggi colorimetrici per valutare la neutralizzazione sono stati impiegati con successo per altri virus come l’influenza e l’adenovirus18,19. La loro attrattiva deriva dalla loro semplicità, dal costo inferiore e dalla necessità di utilizzare solo apparecchiature e strumenti di laboratorio di uso quotidiano20. I saggi NAb che utilizzano un gene reporter basato sulla luminescenza richiedono costosi kit di substrato, un luminometro e un software corrispondente per l’analisi21. Questo test colorimetrico ha il vantaggio di richiedere solo un microscopio ottico e un substrato molto economico. La segnalazione della sensibilità dei saggi colorimetrici rispetto a quelli luminescenti ha prodotto risultati contrastanti. Uno studio ha suggerito che i saggi ELISA basati sulla luminescenza mostrano una maggiore sensibilità e una riproducibilità comparabile ai saggi colorimetrici22, mentre un altro ha scoperto che i saggi ELISA basati sulla colorimetria conferiscono una maggiore sensibilità23. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per un test NAb in vitro contro AAV che utilizza la reazione cromogenica tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e un substrato nitro blu tetrazolio /5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP). Questo protocollo passo-passo è stato sviluppato sulla base di un precedente rapporto che utilizzava un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare umana) (AAV6-hPLAP) per rilevare l’attività neutralizzante contro AAV24. Questo test è conveniente, efficiente in termini di tempo, facile da configurare e richiede competenze tecniche minime, attrezzature di laboratorio e reagenti. Inoltre, la semplicità di questo test gli conferisce il potenziale per essere ottimizzato per ampie applicazioni su diversi tipi di cellule, tessuti o sierotipi virali.
Questo rapporto descrive un saggio colorimetrico che valuta l’entità della neutralizzazione AAV in un dato campione di siero valutando una reazione cromogenica corrispondente al grado di trasduzione virale in vitro. Lo sviluppo del protocollo si è basato sulla nota reazione cromogenica tra l’enzima fosfatasi alcalina e NBT/BCIP, che è stato ampiamente utilizzato come strumento di colorazione per la rilevazione di bersagli proteici in applicazioni come l’immunoistochimica e come strumento reporter per la valut…
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato finanziato da un National Health and Medical Research Council Project Grant a JRM e CJT (ID 1163732) e in parte dal programma di supporto alle infrastrutture operative del governo vittoriano. SB è supportato da una borsa di studio congiunta Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral. KLW è supportato da The Shine On Foundation e da una Future Leader Fellowship della National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM è supportato da una borsa di ricerca senior del National Health and Medical Research Council (ID 1078985).
0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
Aluminium foil | |||
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
Cell and tissue culture safety cabinet | |||
Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Haemocytometer | |||
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
HT1080 cells | ATCC | ||
ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
Oven | For a 65 °C incubation | ||
Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | |||
Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
Water bath |