En trinnvis metode for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot AAV ved hjelp av en kolorimetrisk cellebasert analyse
Summary
En omfattende laboratorieprotokoll og analysearbeidsflyt er beskrevet for en rask, kostnadseffektiv og enkel kolorimetrisk cellebasert analyse for å oppdage nøytraliserende elementer mot AAV6.
Abstract
Rekombinante adeno-assosierte virus (rAAV) har vist seg å være en sikker og vellykket vektor for overføring av genetisk materiale for å behandle ulike helsetilstander i både laboratoriet og klinikken. Imidlertid utgjør eksisterende nøytraliserende antistoffer (NAbs) mot AAV-capsids en pågående utfordring for vellykket administrasjon av genterapier i både store dyreforsøksmodeller og menneskelige populasjoner. Foreløpig screening for vertsimmunitet mot AAV er nødvendig for å sikre effekten av AAV-baserte genterapier som både et forskningsverktøy og som et klinisk levedyktig terapeutisk middel. Denne protokollen beskriver en kolorimetrisk in vitro-analyse for å oppdage nøytraliserende faktorer mot AAV-serotype 6 (AAV6). Analysen benytter reaksjonen mellom en AAV-koding av et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og dets substrat NBT/BCIP, som genererer en uoppløselig kvantifiserbar lilla flekk ved kombinasjon.
I denne protokollen kombineres serumprøver med en AAV som uttrykker AP og inkuberes for å tillate potensiell nøytraliserende aktivitet. Virusserumblanding tilsettes deretter til celler for å muliggjøre viral transduksjon av AAVer som ikke er nøytralisert. NBT/BCIP-substratet tilsettes og gjennomgår en kromogene reaksjon, som tilsvarer viral transduksjon og nøytraliserende aktivitet. Andelen områdefargede er kvantisert ved hjelp av et gratis programvareverktøy for å generere nøytraliserende titere. Denne analysen viser en sterk positiv sammenheng mellom fargelegging og viruskonsentrasjon. Vurdering av serumprøver fra sau før og etter administrering av en rekombinant AAV6 førte til en dramatisk økning i nøytraliserende aktivitet (125 til > økning på 10 000 ganger). Analysen viste tilstrekkelig følsomhet for å oppdage nøytraliserende aktivitet i >1:32,000 serumfortynning. Denne analysen gir en enkel, rask og kostnadseffektiv metode for å oppdage NAbs mot AAVer.
Introduction
Adeno-assosierte virus (AAV) brukes i økende grad som vektorer for levering av genterapier for å prøve behandlinger for ulike helsetilstander som påvirker kardiovaskulære, lunge-, sirkulasjons-, okulære og sentralnervesystemer1,2,3,4,5. Populariteten til AAV-vektorer som en ledende genterapiplattform stammer fra deres positive sikkerhetsprofil, langsiktige transgene uttrykk og omfattende vevsspesifikke tropismer1,6. Vellykkede resultater i dyrestudier har banet vei for over femti kliniske studier av AAV-genterapi som har nådd sine effektendepunkter7, samt utgivelsen av det første kommersielt tilgjengelige AAV-genterapimedisinen godkjent av US Food and Drug Administration8. Etter innledende suksesser har AAV fortsatt å få trekkraft i de grunnleggende og kliniske forskningssektorene som en vektor av valg og er for tiden den eneste in vivo genterapi godkjent for klinisk bruk i USA og Europa9. Likevel, tilstedeværelsen av eksisterende nøytraliserende antistoffer (NAbs) mot AAV vektor capsids er fortsatt en hindring for både preklinisk forskning og effekten av kliniske studier. NAbs er til stede i både naive menneskelige og dyrepopulasjoner og hemmer gentransduksjon etter in vivo-administrering av en AAV-vektor1. AAV seropositivity er et eksklusjonskriterium for de fleste genterapiforsøk, og derfor er foreløpig screening for vertsimmunitet avgjørende i både laboratoriet og klinikken. Etablering av en analyse som kan oppdage tilstedeværelsen av NAbs mot AAV er et viktig skritt i rørledningen til ethvert AAV-genterapibasert forskningsprosjekt. Denne rapporten fokuserer på AAV6 som har vært av interesse for forskere på grunn av sin effektive og selektive transduksjon i strikket muskel (hjerte- og skjelettmuskulatur)1,10,11,12. Genterapi regnes som en lovende strategi for å målrette hjertet fordi det er vanskelig å spesifikt målrette hjertet uten invasive åpne hjerteprosedyrer.
Nøytraliserende aktivitet bestemmes vanligvis ved hjelp av enten en cellebasert in vitro eller in vivo transduksjonsinhiberingsanalyse. In vivo NAb-analyser innebærer vanligvis administrering av serum fra et testemne (f.eks. menneske eller stort dyr) til mus, etterfulgt av en AAV med et reportergen, etterfulgt av testing for uttrykket av reportergenet eller tilsvarende antigen. In vitro-analyser bestemmer NAb-titere ved å inkubere serum eller plasma fra et menneske eller stort dyr i serielle fortynninger med en rekombinant AAV (rAAV) som uttrykker et reportergen. Celler er smittet med serum/virusblandingen, og i hvilken grad reportergenuttrykket hemmes, vurderes sammenlignet med kontroller. In vitro-analyser er mye brukt til NAb-screening på grunn av deres relativt lavere kostnader, hurtighet i testing og større kapasitet for standardisering og validering13,14 sammenlignet med in vivo-analyser. In vivo-analyser rapporteres ofte å ha større følsomhet15,16, men det samme kravet er gjort om de vitro-analyser14,17.
Til dags dato har in vitro NAb-analyser hovedsakelig brukt luminescens (luciferase) som reportergen for å oppdage nøytralisering. Selv om en lysbasert metode har fortjeneste i mange sammenhenger, kan en kolorimetrisk/kromogene NAb-analyse i noen tilfeller være fordelaktig. Kolorimetriske analyser for å vurdere nøytralisering har blitt brukt for andre virus som influensa og adenovirus18,19. Deres attraktivitet stammer fra deres enkelhet, lavere kostnader og kravet til bare hverdagslige laboratorieapparater og verktøy20. NAb-analyser som bruker et luminescensbasert reportergen krever kostbare substratsett, et luminometer og tilsvarende programvare for analyse21. Denne kolorimetriske analysen har fordelen av å bare kreve et lett mikroskop og et veldig billig substrat. Rapportering av sensitiviteten til kolorimetriske versus luminescerende analyser har gitt motstridende resultater. En studie antydet at luminescensbaserte ELISA-analyser viser større følsomhet og sammenlignbar reproduserbarhet for kolorimetriske analyser22, mens en annen fant kolorimetriske ELISA-analyser for å gi større følsomhet23. Her er en detaljert protokoll for en in vitro NAb-analyse mot AAV som utnytter kromogene reaksjonen mellom en AAV-koding av et alkalisk fosfatase (AP) reportergen og et nitroblått tetrazolium /5-bromo-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) substrat gitt. Denne trinnvise protokollen ble utviklet basert på en tidligere rapport som benyttet en hPLAP (human placental alkalisk fosfatase) reportergen (AAV6-hPLAP) for å oppdage nøytraliserende aktivitet mot AAV24. Denne analysen er kostnadseffektiv, tidseffektiv, enkel å sette opp og krever minimale tekniske ferdigheter, laboratorieutstyr og reagenser. Videre gir enkelheten i denne analysen det potensialet til å bli optimalisert for brede applikasjoner på tvers av forskjellige typer celler, vev eller virale serotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapporten beskriver en kolorimetrisk analyse som vurderer omfanget av AAV-nøytralisering i en gitt serumprøve ved å evaluere en kromogene reaksjon som tilsvarer graden av in vitro viral transduksjon. Utviklingen av protokollen var basert på den kjente kromogene reaksjonen mellom enzymet alkalisk fosfatase og NBT/BCIP, som har blitt mye brukt som et fargingsverktøy for påvisning av proteinmål i applikasjoner som immunhiistokjemi og som reporterverktøy for evaluering av viral transduksjon24,33,34,35<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av et National Health and Medical Research Council Project Grant til JRM og CJT (ID 1163732) og delvis av den viktorianske regjeringens operative infrastrukturstøtteprogram. SB støttes av et felles Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW støttes av The Shine On Foundation og future leader fellowship fra National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM støttes av National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
| 75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
| 96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
| Aluminium foil | |||
| Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| Cell and tissue culture safety cabinet | |||
| Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Haemocytometer | |||
| High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 cells | ATCC | ||
| ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
| Oven | For a 65 °C incubation | ||
| Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | |||
| Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
| Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
| Water bath |
References
- Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
- Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
- Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
- Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
- Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
- Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
- Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
- Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
- Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
- Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
- Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
- Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
- Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
- Xiaoli Zhu, T. G. . Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , 237-264 (2019).
- Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
- Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
- Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
- Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
- AAV-HT1080 Cells. Stratagene Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003)
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
- Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
- Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
- Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3′,4′-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
- Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
- Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
- Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
- Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
- Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
- Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
- Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
- Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
- Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
- Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
- Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
- Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
- Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
- Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
- U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
- Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
- Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
- Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).
