JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Пошаговый метод обнаружения нейтрализующих антител против AAV с использованием колориметрического клеточного анализа

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63419
, , , , ,
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology,La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR),The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School,Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health,The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital,Monash University

Summary

Описан комплексный лабораторный протокол и рабочий процесс анализа для быстрого, экономически эффективного и простого колориметрического анализа на основе клеток для обнаружения нейтрализующих элементов против AAV6.

Abstract

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) оказались безопасным и успешным вектором для передачи генетического материала для лечения различных состояний здоровья как в лаборатории, так и в клинике. Тем не менее, ранее существовавшие нейтрализующие антитела (NAbs) против капсидов AAV представляют собой постоянную проблему для успешного введения генной терапии как в экспериментальных моделях крупных животных, так и в человеческих популяциях. Предварительный скрининг на иммунитет хозяина против AAV необходим для обеспечения эффективности генной терапии на основе AAV как исследовательского инструмента, так и в качестве клинически жизнеспособного терапевтического агента. Этот протокол описывает колориметрический анализ in vitro для обнаружения нейтрализующих факторов против серотипа AAV 6 (AAV6). Анализ использует реакцию между AAV, кодирующим ген-репортер щелочной фосфатазы (AP), и его субстратом NBT / BCIP, который генерирует нерастворимое количественно оцениваемое фиолетовое пятно при комбинации.

В этом протоколе образцы сыворотки объединяются с AAV-экспрессирующим AP и инкубируются, чтобы обеспечить потенциальную нейтрализующую активность. Смесь вирусной сыворотки впоследствии добавляется к клеткам, чтобы обеспечить вирусную трансдукцию любых AAV, которые не были нейтрализованы. Субстрат NBT/BCIP добавляется и подвергается хромогенной реакции, соответствующей вирусной трансдукции и нейтрализующей активности. Доля окрашенной площади количественно измеряется с помощью инструмента свободного программного обеспечения для генерации нейтрализующих титров. Этот анализ показывает сильную положительную корреляцию между окраской и концентрацией вируса. Оценка образцов сыворотки крови овец до и после введения рекомбинантного AAV6 привела к резкому увеличению нейтрализующей активности (увеличение в 125->10 000 раз). Анализ показал адекватную чувствительность для выявления нейтрализующей активности в >1:32 000 сывороточных разведений. Этот анализ обеспечивает простой, быстрый и экономически эффективный метод обнаружения NAb против AAV.

Introduction

Аденоассоциированные вирусы (AAV) все чаще используются в качестве векторов для доставки генной терапии для пробного лечения различных состояний здоровья, которые влияют на сердечно-сосудистую, легочную, кровеносную, глазную и центральную нервную системы1,2,3,4,5. Популярность векторов AAV в качестве ведущей платформы генной терапии обусловлена их положительным профилем безопасности, долгосрочной экспрессией трансгенов и широким спектром тканеспецифических тропизмов1,6. Успешные результаты в исследованиях на животных проложили путь для более чем пятидесяти клинических испытаний генной терапии AAV, которые успешно достигли своих конечных точек эффективности7, а также выпуск первого коммерчески доступного препарата генной терапии AAV, одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США8. После первоначальных успехов AAV продолжает набирать обороты в секторах фундаментальных и клинических исследований в качестве вектора выбора и в настоящее время является единственной генной терапией in vivo, одобренной для клинического использования в США и Европе9. Тем не менее, наличие ранее существовавших нейтрализующих антител (NAbs) против капсидов вектора AAV остается препятствием как для доклинических исследований, так и для эффективности клинических испытаний. NAb присутствуют как в наивных популяциях людей, так и в популяциях животных и ингибируют трансдукцию генов после введения in vivo вектора AAV1. Серопозитивность AAV является критерием исключения для большинства испытаний генной терапии, и поэтому предварительный скрининг на иммунитет хозяина имеет решающее значение как в лаборатории, так и в клинике. Создание анализа, который может обнаружить присутствие NAb против AAV, является важным шагом в рамках любого исследовательского проекта на основе генной терапии AAV. В этом отчете основное внимание уделяется AAV6, который представляет интерес для исследователей из-за его эффективной и селективной трансдукции в поперечно-полосатых мышцах (сердце и скелетные мышцы) 1,10,11,12. Генная терапия считается многообещающей стратегией для нацеливания на сердце, потому что трудно конкретно нацелиться на сердце без инвазивных процедур на открытом сердце.

Нейтрализующую активность обычно определяют с помощью клеточного анализа ингибирования трансдукции in vitro или in vivo. In vivo Анализы NAb обычно включают введение сыворотки от испытуемого (например, человека или крупного животного) мышам, за которым следует AAV с репортерным геном, с последующим тестированием экспрессии репортерного гена или соответствующего антигена. Анализы in vitro определяют титры NAb путем инкубации сыворотки или плазмы человека или крупного животного в серийных разведениях рекомбинантным AAV (rAAV), который экспрессирует репортерный ген. Клетки инфицируются смесью сыворотки и вируса, и степень, в которой экспрессия репортерного гена ингибируется, оценивается по сравнению с контрольной группой. Анализы in vitro широко используются для скрининга NAb из-за их сравнительно более низкой стоимости, быстроты тестирования и большей способности к стандартизации и валидации13,14 по сравнению с анализами in vivo. Часто сообщается, что анализы in vivo обладают большей чувствительностью15,16, но то же самое утверждение было сделано в отношении анализов in vitro14,17.

На сегодняшний день анализы in vitro NAb в основном используют люминесценцию (люциферазу) в качестве гена-репортера для обнаружения нейтрализации. Хотя метод, основанный на свете, имеет свои достоинства во многих контекстах, колориметрический/хромогенный анализ NAb может быть полезным в некоторых обстоятельствах. Колориметрические анализы для оценки нейтрализации были успешно использованы для других вирусов, таких как грипп и аденовирус18,19. Их привлекательность проистекает из их простоты, более низкой стоимости и потребности только в повседневной лабораторной аппаратуре и инструментах20. Анализы NAb, в которых используется репортерный ген на основе люминесценции, требуют дорогостоящих наборов субстратов, люминометра и соответствующего программного обеспечения для анализа21. Этот колориметрический анализ имеет то преимущество, что требует только светового микроскопа и очень дешевой подложки. Отчетность о чувствительности колориметрических и люминесцентных анализов дала противоречивые результаты. Одно исследование показало, что анализы ИФА на основе люминесценции демонстрируют большую чувствительность и сопоставимую воспроизводимость с колориметрическими анализами22, в то время как другое обнаружило, что анализы ИФА на основе колориметрии придают большую чувствительность23. Здесь представлен подробный протокол для анализа in vitro NAb против AAV, который использует хромогенную реакцию между AAV, кодирующим ген-репортер щелочной фосфатазы (AP), и нитро-синим тетразолием / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатным (NBT / BCIP) субстратом. Этот пошаговый протокол был разработан на основе предыдущего отчета, в котором использовался ген-репортер hPLAP (человеческая плацентарная щелочная фосфатаза) (AAV6-hPLAP) для обнаружения нейтрализующей активности против AAV24. Этот анализ является экономически эффективным, эффективным по времени, простым в настройке и требует минимальных технических навыков, лабораторного оборудования и реагентов. Кроме того, простота этого анализа дает ему возможность быть оптимизированным для широкого применения в различных типах клеток, тканей или вирусных серотипов.

Protocol

Все аспекты ухода за животными и экспериментов проводились в соответствии с руководящими принципами Института неврологии и психического здоровья Флори и Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях после ссылки25. Для исследования испо?…

Representative Results

Трансдукционный анализ для установления оптимальной вирусной дозировки для покрытия пластинДля этого анализа были отобраны клетки HT1080, хорошо зарекомендовавшая себя клеточная линия фибросаркомы. Концентрация 1 х 104 HT1080 клеток/лунка обеспечивала ~50% клеточного слияни…

Discussion

В этом отчете описывается колориметрический анализ, который оценивает степень нейтрализации AAV в данном образце сыворотки путем оценки хромогенной реакции, соответствующей степени вирусной трансдукции in vitro. Разработка протокола была основана на известной хромогенной реакции м?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось грантом Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям JRM и CJT (ID 1163732) и частично Программой поддержки оперативной инфраструктуры правительства Виктории. SB поддерживается совместной докторской стипендией Института сердца и диабета Бейкера и Университета Ла Троуб. KLW поддерживается Фондом «Сияние» и стипендией «Будущий лидер» от Национального фонда сердца Австралии (ID 102539). JRM поддерживается Старшим научным сотрудником Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (ID 1078985).

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. . Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003)
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3′,4′-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Tags

Neutralizing AntibodiesAAV Gene TherapyColorimetric Cell-based AssayHT1080 CellsSerum DilutionsViral GenomeParaformaldehydeAlkaline PhosphataseBCIP/NBTMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image