Un método paso a paso para detectar anticuerpos neutralizantes contra AAV utilizando un ensayo colorimétrico basado en células
Summary
Se describe un protocolo de laboratorio completo y un flujo de trabajo de análisis para un ensayo basado en células colorimétricas rápidas, rentables y sencillas para detectar elementos neutralizantes contra AAV6.
Abstract
Los virus adenoasociados recombinantes (rAAV) han demostrado ser un vector seguro y exitoso para transferir material genético para tratar diversas afecciones de salud tanto en el laboratorio como en la clínica. Sin embargo, los anticuerpos neutralizantes preexistentes (NAbs) contra las cápsides AAV plantean un desafío continuo para la administración exitosa de terapias génicas tanto en modelos experimentales de animales grandes como en poblaciones humanas. El cribado preliminar de la inmunidad del huésped contra el AAV es necesario para garantizar la eficacia de las terapias génicas basadas en el AAV como herramienta de investigación y como agente terapéutico clínicamente viable. Este protocolo describe un ensayo colorimétrico in vitro para detectar factores neutralizantes frente al serotipo 6 de AAV (AAV6). El ensayo utiliza la reacción entre un AAV que codifica un gen reportero de fosfatasa alcalina (AP) y su sustrato NBT / BCIP, que genera una mancha púrpura cuantificable insoluble al combinarse.
En este protocolo, las muestras de suero se combinan con un AAV que expresa AP y se incuban para permitir que ocurra una posible actividad neutralizante. La mezcla de suero de virus se agrega posteriormente a las células para permitir la transducción viral de cualquier AAV que no haya sido neutralizado. Se añade el sustrato NBT/BCIP y sufre una reacción cromogénica, correspondiente a la transducción viral y a la actividad neutralizante. La proporción de área coloreada se cuantifica utilizando una herramienta de software libre para generar títulos neutralizantes. Este ensayo muestra una fuerte correlación positiva entre la coloración y la concentración viral. La evaluación de muestras de suero de ovejas antes y después de la administración de un AAV6 recombinante condujo a un aumento dramático en la actividad neutralizante (aumento de 125 a >10,000 veces). El ensayo mostró una sensibilidad adecuada para detectar actividad neutralizante en diluciones séricas > 1:32.000. Este ensayo proporciona un método simple, rápido y rentable para detectar NAbs contra AAV.
Introduction
Los virus adenoasociados (AAV) se utilizan cada vez más como vectores para la administración de terapias génicas para probar tratamientos para diversas afecciones de salud que afectan los sistemas cardiovascular, pulmonar, circulatorio, ocular y nervioso central1,2,3,4,5. La popularidad de los vectores AAV como plataforma líder de terapia génica se deriva de su perfil de seguridad positivo, la expresión transgénica a largo plazo y los tropismos específicos de tejidos de amplio alcance1,6. Los resultados exitosos en estudios con animales han allanado el camino para más de cincuenta ensayos clínicos de terapia génica AAV que han alcanzado con éxito sus criterios de valoración de eficacia7, así como el lanzamiento del primer medicamento de terapia génica AAV disponible comercialmente aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos8. Tras los éxitos iniciales, AAV ha seguido ganando terreno en los sectores de investigación básica y clínica como vector de elección y actualmente es la única terapia génica in vivo aprobada para uso clínico en los Estados Unidos y Europa9. No obstante, la presencia de anticuerpos neutralizantes preexistentes (NAbs) contra las cápsides del vector AAV sigue siendo un obstáculo tanto para la investigación preclínica como para la eficacia de los ensayos clínicos. Los NAbs están presentes tanto en poblaciones humanas como animales ingenuas e inhiben la transducción de genes después de la administración in vivo de un vector AAV1. La seropositividad al AAV es un criterio de exclusión para la mayoría de los ensayos de terapia génica y, por lo tanto, la detección preliminar de la inmunidad del huésped es crucial tanto en el laboratorio como en la clínica. Establecer un ensayo que pueda detectar la presencia de NAbs contra AAV es un paso esencial en la tubería de cualquier proyecto de investigación basado en la terapia génica AAV. Este informe se centra en el AAV6 que ha sido de interés para los investigadores debido a su transducción eficiente y selectiva en el músculo estriado (corazón y músculo esquelético)1,10,11,12. La terapia génica se considera una estrategia prometedora para dirigirse al corazón porque es difícil dirigirse específicamente al corazón sin procedimientos invasivos a corazón abierto.
La actividad neutralizante generalmente se determina utilizando un ensayo de inhibición de la transducción in vitro o in vivo basado en células. In vivo Los ensayos de NAb generalmente implican la administración de suero de un sujeto de prueba (por ejemplo, humano o animal grande) en ratones, seguido de un AAV con un gen reportero, seguido de pruebas para la expresión del gen reportero o antígeno correspondiente. Los ensayos in vitro determinan los títulos de NAb incubando suero o plasma de un humano o animal grande en diluciones seriadas con un AAV recombinante (rAAV) que expresa un gen reportero. Las células están infectadas con la mezcla de suero /virus, y se evalúa el grado en que se inhibe la expresión génica del informador en comparación con los controles. Los ensayos in vitro son ampliamente utilizados para el cribado de NAb debido a su costo comparativamente menor, rapidez en las pruebas y mayor capacidad de estandarización y validación13,14 en comparación con los ensayos in vivo. A menudo se ha informado que los ensayos in vivo tienen mayor sensibilidad15,16, pero lo mismo se ha hecho con respecto a los ensayos de vitro14,17.
Hasta la fecha, los ensayos in vitro de NAb han utilizado principalmente la luminiscencia (luciferasa) como gen reportero para detectar la neutralización. Aunque un método basado en la luz tiene mérito en muchos contextos, un ensayo de NAb colorimétrico / cromogénico puede ser ventajoso en algunas circunstancias. Los ensayos colorimétricos para evaluar la neutralización se han empleado con éxito para otros virus como la influenza y el adenovirus18,19. Su atractivo se deriva de su simplicidad, menor costo y la necesidad de solo aparatos y herramientas de laboratorio cotidianos20. Los ensayos de NAb que utilizan un gen reportero basado en luminiscencia requieren costosos kits de sustrato, un luminómetro y el software correspondiente para el análisis21. Este ensayo colorimétrico tiene la ventaja de que solo requiere un microscopio de luz y un sustrato muy barato. El informe de la sensibilidad de los ensayos colorimétricos frente a los luminiscentes ha arrojado resultados contradictorios. Un estudio sugirió que los ensayos ELISA basados en luminiscencia muestran una mayor sensibilidad y reproducibilidad comparable a los ensayos colorimétricos22, mientras que otro encontró que los ensayos ELISA basados en colorimetría confieren una mayor sensibilidad23. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para un ensayo in vitro de NAb contra AAV que utiliza la reacción cromogénica entre un AAV que codifica un gen reportero de fosfatasa alcalina (AP) y un sustrato de tetrazolio azul nitro / 5-bromo-4-cloro-3-fosfato de indolilo (NBT / BCIP). Este protocolo paso a paso se desarrolló en base a un informe anterior que utilizó un gen reportero hPLAP (fosfatasa alcalina placentaria humana) (AAV6-hPLAP) para detectar la actividad neutralizante contra AAV24. Este ensayo es rentable, eficiente en el tiempo, fácil de configurar y requiere habilidades técnicas mínimas, equipos de laboratorio y reactivos. Además, la simplicidad de este ensayo le da el potencial de ser optimizado para aplicaciones amplias en diferentes tipos de células, tejidos o serotipos virales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe describe un ensayo colorimétrico que evalúa el grado de neutralización de AAV en una muestra de suero dada mediante la evaluación de una reacción cromogénica correspondiente al grado de transducción viral in vitro. El desarrollo del protocolo se basó en la conocida reacción cromogénica entre la enzima fosfatasa alcalina y NBT/BCIP, que ha sido ampliamente utilizada como herramienta de tinción para la detección de dianas proteicas en aplicaciones como la inmunohistoquímica y como herrami…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por una subvención del Proyecto del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica a JRM y CJT (ID 1163732) y en parte por el Programa de Apoyo de Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria. SB cuenta con el apoyo de una beca doctoral conjunta baker heart and diabetes Institute-La Trobe University. KLW cuenta con el apoyo de The Shine On Foundation y una beca Future Leader Fellowship de la National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM cuenta con el apoyo de una beca de investigación sénior del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (ID 1078985).
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
| 75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
| 96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
| Aluminium foil | |||
| Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| Cell and tissue culture safety cabinet | |||
| Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Haemocytometer | |||
| High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 cells | ATCC | ||
| ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
| Oven | For a 65 °C incubation | ||
| Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | |||
| Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
| Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
| Water bath |
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