マイクロCTスキャンを活用して寄生植物と宿主の相互作用を解析
Summary
マイクロCTは、植物の構造を3次元で解析できる非破壊ツールです。本プロトコルは、寄生植物の構造と機能を分析するためにマイクロCTを活用するためのサンプル調製について説明しています。特定の調製物と組み合わせた場合のこの方法の利点を強調するために、異なる種が使用される。
Abstract
マイクロCTスキャンは、植物の構造と機能を調査するための確立されたツールになりました。その非破壊的な性質は、3次元の視覚化と仮想セクショニングの可能性と相まって、複雑な植物器官の斬新でますます詳細な分析を可能にしました。寄生植物とその宿主の間を含む植物間の相互作用も調査できます。ただし、スキャン前のサンプル調製は、組織組織や組成が異なることが多いこれらの植物間の相互作用のために重要になります。さらに、高度に減少した栄養体から樹木、ハーブ、低木に至るまで、寄生顕花植物の幅広い多様性は、寄生虫宿主材料のサンプリング、処理、および調製中に考慮する必要があります。ここでは、寄生虫および/または宿主植物にコントラスト溶液を導入するための2つの異なるアプローチが、吸器の分析に焦点を当てて説明されています。この器官は、2つの植物間のつながりとコミュニケーションを促進します。簡単なアプローチに従って、ユーストリウム組織組織の詳細を、真正植物、つる、ヤドリギの寄生種についてここに示すように、3次元で探索することができます。特定の造影剤と適用アプローチを選択することで、宿主体内での内部寄生虫の広がりを詳細に観察し、寄生生物と宿主の間の直接的な血管間接続を検出することもできます。したがって、ここで説明するプロトコルは、寄生顕花植物の幅広い多様性に適用して、それらの発達、構造、および機能の理解を進めることができます。
Introduction
高解像度X線マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)は、サンプルの複数のX線写真(投影)を異なる視野角から記録し、後でサンプル1の仮想再構成を提供するイメージング方法です。この仮想オブジェクトは、分析、操作、およびセグメント化できるため、3次元での非破壊的な探索が可能になります2。当初は医療分析用に設計され、後に産業用途向けに設計されたマイクロCTは、侵襲的な手順を必要とせずに内臓や組織を視覚化できるという利点も提供します3。他の形式のイメージングと同様に、マイクロCTは視野とピクセルサイズのトレードオフを伴うため、大きなサンプルの高解像度イメージングはほとんど達成できません4。高エネルギーX線源(すなわち、シンクロトロン)および二次光学倍率の使用の進歩は絶えず行われており、最小分解能は100nm未満に達することができる5,6。それにもかかわらず、大きなサンプルではより長いスキャン時間が必要であり、サンプルの移動やスキャナー内の変形によるアーチファクトの可能性が高まります。さらに、マイクロCTは一般に、サンプル内の自然な密度変動と、サンプルがX線とどのように相互作用するかによって制限されます。密度の高いサンプルを透過するには、より高いX線量が最適ですが、サンプルとその周囲の媒体の内部および間の密度の変動をキャプチャするには効率が低くなります7。一方、X線量が少ないほど浸透力が低くなり、多くの場合、スキャン時間が長くなりますが、密度検出の感度が高くなります7。
これらの制限は、ほとんどの植物組織がX線吸収の低い軽い(非高密度)組織で構成されていることを考えると、植物科学のためのマイクロトモグラフィーの使用を長い間妨げてきました8。マイクロCTの最初のアプリケーションは、土壌マトリックス内の根のネットワークのマッピングに焦点を当てていました9,10。その後、木材など、組織密度により大きな違いがある植物の構造が調査され始めました。これにより、木部機能11,12、複雑な組織組織の開発13、14、および植物間の相互作用15、16、17の調査が可能になりました。植物サンプルのマイクロCTスキャンの準備における標準的な手順である造影剤により、柔らかく均質な組織の分析が普及しています。ただし、コントラスト導入のプロトコルは、サンプル量、構造特性、および使用する溶液の種類に応じて異なる結果をもたらす可能性があります8。理想的には、造影剤は、異なる組織間の区別を強化し、組織/臓器の機能評価を可能にし、および/または組織に関する生化学的情報を提供するべきである18。したがって、スキャン前の適切なサンプル処理、準備、および取り付けは、マイクロCT分析にとって重要になります。
寄生植物吸器のマイクロCT
寄生顕花植物は、 ハウストリウム19として知られる器官によって特徴付けられる被子植物の明確な官能基を表す。この多細胞器官は、改変された茎と根との間の発生ハイブリッドであり、宿主の付着、侵入、および寄生虫による接触に作用する20。このため、ハウストリアムは「植物間の寄生のアイデアそのものを体現している」と考えられています21。この器官の発達、構造、および機能の詳細な理解は、寄生植物の生態学、進化、および管理研究にとって非常に重要です。それにもかかわらず、寄生植物の全体的な複雑さと高度に変更された構造と吸器は、詳細な分析と比較を妨げることがよくあります。また、ハウストリウムの接続は通常広範囲に及び、組織や細胞の分布が均一ではありません(図1)。これに関連して、小さな組織片を扱うことはより簡単な操作およびより高い解像度を可能にするが、寄生植物吸器のような複雑な構造の三次元構造についての誤った結論につながる可能性がある。
ほとんどの寄生植物種の吸器の解剖学と超微細構造に関する膨大な文献がありますが、寄生虫と宿主組織の間の3次元構成と空間的関係は十分に調査されていません17。増本らによる最近の研究では、300を超える連続した半薄ミクロトーム切片が画像化され、2つの寄生虫種の吸器を表す3次元仮想オブジェクトに再構築されました。この方法の優れた詳細レベルは、吸器の細胞および解剖学的3D構造に関する前例のない洞察を提供します。しかしながら、そのような時間のかかる技術は、より広範な吸器接続を有する寄生虫における同様の分析を禁じるであろう。マイクロCTの使用は、寄生植物の複雑でしばしばかさばる吸器の三次元分析のための優れたツールとして浮上しています。詳細な解剖学的切片やその他の補完的な形式の顕微鏡分析17,23に代わるものではありませんが、マイクロCTスキャン、特に大きなサンプルで得られた結果は、共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの他のツールを使用して分析したり、高解像度マイクロCTシステムで再分析したりできる、より小さなセグメントのサブサンプリングを指示するためのガイドとしても役立ちます。
図1:このプロトコルで使用される異なる官能基の寄生植物。 真正虫寄生虫 Pyrularia pubera (A)、緑色の果実(破線の黒い円)を持つ内部寄生虫 Viscum minimum (B)、寄生つる Cuscuta americana (C)、ヤドリギ Struthanthus martianus (D)、偏性根寄生虫 Scybalium fungiforme (E)。宿主根(Hr)または茎(Hs)のセグメントは、寄生虫吸器(P)への造影剤の適用を容易にする。サンプル中に寄生虫の母根/茎(矢印)が存在するため、ハウストリウム血管の構成を分析できます。長方形は、分析に使用されるサンプルのセグメントを示します。スケールバー = 2 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
マイクロCTが植物科学でますます普及する技術になるにつれて、サンプルスキャン、3次元再構成、セグメンテーション、および分析を扱うガイド、プロトコル、および文献があります3,10,24。したがって、これらの手順についてはここでは説明しません。他の想像技術と同様に、サンプルの適切な処理とマウントは基本ですが、見過ごされがちな手順です。このため、このプロトコルは、マイクロCTスキャン用のハウストリウムサンプルの調製に焦点を当てています。より具体的には、このプロトコルは、吸器サンプルに造影剤を導入して、吸器内のさまざまな組織および細胞タイプの視覚化を改善し、宿主の根/茎内の寄生組織の検出を容易にし、寄生虫と宿主の血管接続を3次元で分析するための2つのアプローチについて説明します。ここに記載されている調製物は、他の植物構造の分析にも適合させることができる。
ここで説明するプロトコルの利便性をよりよく説明するために、5つの種が使用されました。それぞれの種は寄生顕花植物の5つの機能グループの1つを表し、したがって各グループの機能に関連する特定のポイントに対処します。 Pyrularia pubera (サンタラ科)は、地面で発芽し、寄生虫を宿主の根に接続する複数の吸器を形成する真正寄生虫を表すために選択されました25。これらの植物によって作られた吸器は、しばしば希薄であり、宿主26 から容易に引き裂かれ(図1A)、したがって、より繊細な取り扱いプロセスを必要とする。内部寄生虫は、ここではビス カムミニマム(ビス カ科)で表されます。この機能群の種は、宿主の体外で短期間しか見えず(図1B)、宿主組織内に埋め込まれた細胞の有意に減少した菌糸様鎖としてライフサイクルのほとんどを生きる25。第3の機能群は寄生ブドウ植物を含み、これは地上で発芽するが、宿主植物の茎 に付着する複数の吸器に依存して、初歩的な根のみを形成する(図1C)。ここで、この官能基は クスクタアメリカーナ (コンボルブラ科)によって表される。寄生するブドウの木とは対照的に、ヤドリギは宿主植物の枝に直接発芽し、複数または孤立した吸器を発達させます25。この機能グループを説明するために選択された種は、宿主枝とさまざまな接続を形成する Struthanthus martianus (ロランサス科)です(図1D)。マイクロCTと光学顕微鏡の組み合わせを用いた孤立性ヤドリギ・ハウストリアの分析は、Teixeira-Costa & Ceccantini17で見ることができる。最後に、絶対根寄生生物は、地上で発芽し、宿主植物の根を貫通する種で構成され、最も初期の成長段階から完全に依存しています25。これらの植物は、ここでは大きな塊茎のような吸器を生成する Scybalium fungiforme (バラノフォラ科)によって表されます(図1E)。
このプロトコルで使用された全ての植物試料を、70%ホルマリン酢酸アルコール(FAA 70)中で固定した。サンプリング時の固定は、特にその後の解剖学的分析が必要な場合に、植物組織を保存するために重要です。寄生植物吸器の場合、この器官は主に木化していない実質細胞20で構成されることが多いため、固定も不可欠です。固定液の調製を含む植物組織固定の詳細なプロトコルは、他の場所27で見つけることができます。一方、多かれ少なかれ、固定剤はサンプルの物理的および化学的特性の変化を引き起こす可能性があり、特定の生体力学的および組織化学的分析には適していません。したがって、新鮮なサンプル、すなわち調製直前に収集された非固定材料も、このプロトコルと共に使用することができる。新鮮なサンプルの取り扱い方法の詳細と、固定された材料のトラブルシューティングの提案は、ディスカッションセクションに記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物組織のコントラストを改善するための重金属溶液の使用は、マイクロCT分析のためのサンプル調製における重要なステップとなっています。植物のマイクロ形態学研究所で一般的に入手可能ないくつかの化合物がStaedlerらによってテストされており、サンプルの浸透とコントラスト指数の増加に最も効果的な薬剤としてリンタングステン酸を使用することを推奨していま…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シモーネ・ゴメス・フェレイラ博士(ブラジル、サンパウロ大学マイクロトモグラフィー研究所)とグレッグ・リン博士(ハーバード大学ナノスケールシステムセンター、米国)には、さまざまなマイクロトモグラフィーシステムとデータ解析ソフトウェアに関する最も重要な支援と不可欠なユーザートレーニングに感謝します。また、コネチカット大学(米国)のEEB温室のスタッフ、特に ビスカムミニマムの標本を提供してくれたクリントンモースとマシューオペルにも感謝します。ジョン・ウェンツェル博士は、 Pyrularia puberaのサンプリングの機会と大きな助けを提供しました。Carolina Bastos修士、Yasmin Hirao修士、Talitha Mottaは、 Scybalium fungiformeのサンプリングに大いに役立ちました。アリアドネ・フルタド博士、フェルナンダ・オリベイラ博士、マリア・アリーン・ネベス博士は、内生性真菌の分析にフロキシンBを使用するためのリファレンスを提供しました。ブリュッセル自由大学でのビデオ録画は、フィリップ・クレイス博士、クリストフ・スヌーク博士、ジェイク・グリフィス修士、バラバラ・ヴェセルカ博士、ハリー・オールド・ヴェンテリンク博士の助けを借りて可能になりました。資金は、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)とハーバード大学ハーバリア(米国)によって提供されました。
Materials
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
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