Udnyttelse af mikro-CT-scanning til at analysere parasitære plante-værtsinteraktioner

Summary

Micro-CT er et ikke-destruktivt værktøj, der kan analysere plantestrukturer i tre dimensioner. Denne protokol beskriver prøveforberedelsen for at udnytte mikro-CT til at analysere parasitisk plantestruktur og funktion. Forskellige arter bruges til at fremhæve fordelene ved denne metode, når de kombineres med specifikke præparater.

Abstract

Micro-CT-scanning er blevet et etableret værktøj til at undersøge planters struktur og funktion. Dens ikke-destruktive karakter kombineret med muligheden for tredimensionel visualisering og virtuel sektionering har muliggjort ny og stadig mere detaljeret analyse af komplekse planteorganer. Interaktioner mellem planter, herunder mellem parasitære planter og deres værter, kan også udforskes. Imidlertid bliver prøveforberedelse før scanning afgørende på grund af interaktionen mellem disse planter, som ofte adskiller sig i vævsorganisation og sammensætning. Desuden skal den brede mangfoldighed af parasitiske blomstrende planter, der spænder fra stærkt reducerede vegetative kroppe til træer, urter og buske, overvejes under prøveudtagning, behandling og forberedelse af parasitværtsmateriale. Her beskrives to forskellige tilgange til introduktion af kontrastopløsninger i parasitten og/eller værtsplanterne med fokus på analyse af haustorium. Dette organ fremmer forbindelse og kommunikation mellem de to planter. Efter en simpel tilgang kan detaljer om haustoriumvævsorganisation udforskes tredimensionelt, som vist her for euphytoid-, vin- og misteltenparasitære arter. Valg af specifikke kontrastmidler og anvendelsesmetoder muliggør også detaljeret observation af endoparasitspredning i værtskroppen og påvisning af direkte fartøj-til-fartøj-forbindelse mellem parasit og vært, som vist her for en obligatorisk rodparasit. Således kan protokollen, der diskuteres her, anvendes på den brede mangfoldighed af parasitære blomstrende planter for at fremme forståelsen af deres udvikling, struktur og funktion.

Introduction

Højopløselig røntgenmikrocomputertomografi (mikro-CT) er en billeddannelsesmetode, hvor flere røntgenbilleder (fremskrivninger) af en prøve registreres fra forskellige synsvinkler og senere bruges til at tilvejebringe en virtuel rekonstruktion af prøven¹. Dette virtuelle objekt kan derefter analyseres, manipuleres og segmenteres, hvilket tillader ikke-destruktiv udforskning i tre dimensioner². Oprindeligt designet til medicinske analyser og senere til industrielle applikationer, giver mikro-CT også fordelen ved at visualisere indre organer og væv uden behov for invasive procedurer³. Ligesom andre former for billeddannelse arbejder mikro-CT med en afvejning mellem synsfeltet og pixelstørrelsen, hvilket betyder, at billeddannelse i høj opløsning af store prøver er næsten uopnåelig⁴. Der gøres konstant fremskridt inden for brug af røntgenkilder med høj energi (dvs. synkrotron) og sekundær optisk forstørrelse, hvilket gør det muligt for den mindste opløsning at nå under 100 nm ^5,6. Ikke desto mindre er længere scanningstider nødvendige for store prøver, hvilket øger chancen for artefakter på grund af prøvebevægelse eller deformation inde i scanneren. Desuden er mikro-CT generelt begrænset af naturlige densitetsvariationer i prøven, og hvordan prøven interagerer med røntgenstråler. Mens en højere røntgendosis er bedst til at trænge ind i tættere prøver, er den mindre effektiv til at fange variationer i densitet inden for og mellem prøven og dens omgivende medium⁷. På den anden side giver en lavere røntgendosis mindre penetrationskraft og kræver ofte længere scanningstider, men mere følsomhed i densitetsdetektion⁷.

Disse begrænsninger har længe hæmmet brugen af mikrotomografi til plantevidenskab, da de fleste plantevæv består af let (ikke-tæt) væv med lav røntgenabsorption⁸. De første anvendelser af mikro-CT var fokuseret på kortlægning af rodnetværk inden for jordmatrixen ^9,10. Senere begyndte plantestrukturer med mere signifikante forskelle i vævstæthed, såsom træ, at blive udforsket. Dette har muliggjort undersøgelser af xylemfunktionalitet^11,12, udvikling af komplekse vævsorganisationer 13,14 og interaktioner mellem planter^15,16,17. Analysen af blødt og homogent væv bliver udbredt på grund af kontrastmidler, som nu er standardprocedure i forberedelser til mikro-CT-scanning af planteprøver. Protokoller til kontrastintroduktion kan dog have forskellige resultater afhængigt af prøvevolumen, strukturelle egenskaber og den anvendte opløsningstype⁸. Ideelt set bør kontrastmidlet øge sondringen mellem forskellige væv, muliggøre evaluering af vævs-/organfunktionalitet og/eller give biokemisk information om et væv¹⁸. Derfor bliver tilstrækkelig prøvebehandling, forberedelse og montering før scanning afgørende for enhver mikro-CT-analyse.

Micro-CT af den parasitære plante haustorium
Parasitiske blomstrende planter repræsenterer en særskilt funktionel gruppe af angiospermer karakteriseret ved et organ kendt som haustorium¹⁹. Dette flercellede organ, en udviklingshybrid mellem en modificeret stamme og en rod, virker på værtens fastgørelse, penetration og kontakt med en parasit²⁰. Af denne grund anses haustoriet for at “legemliggøre selve ideen om parasitisme blandt planter”²¹. En detaljeret forståelse af dette organs udvikling, struktur og funktion er afgørende for parasitisk planteøkologi, evolution og ledelsesstudier. Ikke desto mindre hindrer parasitiske planters overordnede kompleksitet og stærkt modificerede struktur og haustoria ofte detaljeret analyse og sammenligning. Haustoriumforbindelser er normalt også omfattende og ikke homogene i vævs- og cellefordeling (figur 1). I denne sammenhæng, mens arbejde med små vævsfragmenter tillader lettere manipulation og højere opløsning, kan det føre til fejlagtige konklusioner om den tredimensionale arkitektur af komplekse strukturer, såsom det parasitære plantehaustorium.

Selvom der findes en omfattende litteratur om haustoriumanatomi og ultrastruktur for de fleste parasitære plantearter, er den tredimensionelle organisation og det rumlige forhold mellem parasit og værtsvæv stadig dårligt udforsket¹⁷. I et nyligt arbejde af Masumoto et ^al.22 blev over 300 serielle halvtynde mikrotomsektioner afbildet og rekonstrueret til et tredimensionelt virtuelt objekt, der repræsenterer haustorium af to parasitarter. Denne metodes fremragende detaljeringsgrad giver hidtil uset indsigt i haustoriets cellulære og anatomiske 3D-struktur. En sådan tidskrævende teknik ville imidlertid forbyde en lignende analyse i parasitter med mere omfattende haustoriumforbindelser. Anvendelsen af mikro-CT fremstår som et glimrende værktøj til tredimensionel analyse af komplekse og ofte omfangsrige haustoria af parasitære planter. Selvom det ikke er en erstatning for detaljeret anatomisk sektionering og andre komplementære former for mikroskopianalyser^17,23, kan resultater opnået via mikro-CT-scanning, især for store prøver, også tjene som vejledning til at styre delprøveudtagningen af mindre segmenter, som derefter kan analyseres ved hjælp af andre værktøjer, såsom konfokal og elektronmikroskopi^, eller genanalyseres med mikro-CT-systemer med høj opløsning.

Figur 1: Parasitære planter af forskellige funktionelle grupper, der anvendes i denne protokol. Euphytoid parasit Pyrularia pubera (A), endoparasit Viscum minimum (B) med grønne frugter (stiplet sort cirkel), parasitisk vin Cuscuta americana (C), mistelten Struthanthus martianus (D), obligatorisk rodparasit Scybalium fungiforme (E). Segmenter af værtsroten (Hr) eller stammen (Hs) letter anvendelsen af kontrast i parasithaustorium (P). Tilstedeværelsen af parasitmoderrod/-stamme (pile) i prøven muliggør analyse af haustoriumbeholdernes organisation. Rektangler angiver segmenter af prøven, der anvendes til analyse. Vægtstænger = 2 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Da mikro-CT bliver en stadig mere populær teknik inden for plantevidenskab, er der vejledninger, protokoller og litteratur, der beskæftiger sig med prøvescanning, tredimensionel rekonstruktion, segmentering og analyse ^3,10,24. Således vil disse trin ikke blive diskuteret her. Som med enhver fantasiteknik er passende behandling og montering af prøver en grundlæggende, omend ofte en overset procedure. Af denne grund fokuserer denne protokol på forberedelse af haustoriumprøver til mikro-CT-scanning. Mere specifikt beskriver denne protokol to tilgange til introduktion af kontrastmidler i haustoriumprøver for at forbedre visualiseringen af forskellige væv og celletyper i haustorium, for at lette påvisningen af parasitisk væv i værtsroden/stammen og for at analysere parasit-vært vaskulære forbindelser i tre dimensioner. De her beskrevne præparater kan også tilpasses analysen af andre plantestrukturer.

Fem arter blev brugt til bedre at illustrere bekvemmeligheden ved den her beskrevne protokol. Hver art repræsenterer en af de fem funktionelle grupper af parasitære blomstrende planter og adresserer således specifikke punkter relateret til hver gruppes funktionalitet. Pyrularia pubera (Santalaceae) blev valgt til at repræsentere euphytoide parasitter, som spirer i jorden og danner flere haustoria, der forbinder parasitten med rødderne af sine værter²⁵. Haustoria skabt af disse planter er ofte spinkle og let revet fra hinanden fra værten²⁶ (figur 1A), hvilket kræver en mere delikat håndteringsproces. Endoparasitter er repræsenteret her af Viscum minimum (Viscaceae). Arter i denne funktionelle gruppe er kun synlige uden for deres værters krop i korte perioder (figur 1B) og lever det meste af deres livscyklus som signifikant reducerede og mycellignende cellestrenge indlejret i værtsvæv²⁵. En tredje funktionel gruppe omfatter parasitære vinstokke, der spirer på jorden, men kun danner rudimentære rødder, der er afhængige af flere haustoria, der fastgøres til stænglerne af værtsplanter²⁵ (figur 1C). Her er denne funktionelle gruppe repræsenteret af Cuscuta americana (Convolvulaceae). I modsætning til parasitære vinstokke spirer mistelten direkte på grenene på deres værtsplanter og udvikler enten flere eller ensomme haustoria²⁵. Den art, der er valgt til at illustrere denne funktionelle gruppe, er Struthanthus martianus (Loranthaceae), som danner forskellige forbindelser med værtsgrenen (figur 1D). Analyse af ensom mistelten haustoria ved hjælp af en kombination af mikro-CT og lysmikroskopi findes i Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Endelig omfatter obligatoriske rodparasitter arter, der spirer på jorden og trænger ind i værtsplanternes rødder, som de er helt afhængige af fra de tidligste vækststadier²⁵. Disse planter er her repræsenteret af Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), som producerer store knoldlignende haustoria (figur 1E).

Alle planteprøver, der blev anvendt i denne protokol, blev fastgjort i en 70% formalin eddikesyrealkohol (FAA 70). Fiksering ved prøvetagning er afgørende for at bevare plantevæv, især hvis der er behov for efterfølgende anatomiske analyser. I tilfælde af parasitisk plantehaustorium er fiksering også afgørende, da dette organ ofte primært består af ikke-lignificerede parenkymceller²⁰. Detaljerede protokoller for fiksering af plantevæv, herunder fremstilling af fikseringsopløsninger, findes andetsteds²⁷. På den anden side kan fikseringsmidler i større eller mindre grad forårsage ændringer i en prøves fysiske og kemiske egenskaber, hvilket gør den uegnet til specifikke biomekaniske og histokemiske analyser. Således kan friske prøver, dvs. ikke-fikseret materiale indsamlet umiddelbart før tilberedning, også anvendes med denne protokol. Detaljer om, hvordan man håndterer nye prøver og fejlfindingsforslag til fikseret materiale, findes i diskussionsafsnittet.

Protocol

1. Valg af parasitisk planteprøve Saml hele parasitplanten haustorium, inklusive den vedhæftede værtsstamme / rod og segmenter af både proksimale og distale ender af det parasiterede værtsorgan; Den ideelle længde af hvert segment svarer til dobbelt diameter af haustorium.BEMÆRK: For lateral haustoria skal du inkludere en del af parasitmoderstammen / roden, hvorfra haustoriet blev dannet (figur 1A, B, D). For endoparasitter indsamles et …

Representative Results

Haustorium af parasitære planter er et komplekst organ, der omfatter forskellige væv og celletyper, der fletter sig sammen og forbinder med væv fra en anden plante, der anvendes som vært20. Micro-CT-scanning kan udnyttes til bedre at forstå denne komplekse struktur på en ikke-destruktiv og tredimensionel måde, når man analyserer både små (figur 1A-C) og store (figur 1D, E) haustoria.<strong class="xfig"…

Discussion

Brugen af tungmetalopløsninger til forbedring af plantevævskontrast er blevet et afgørende skridt i prøveforberedelse til mikro-CT-analyse. Flere forbindelser, der almindeligvis er tilgængelige i plantemikromorfologilaboratorier, er blevet testet af Staedler et al., Der anbefaler at bruge phosphotungstate som det mest effektive middel til penetrerende prøver og øge kontrastindeks⁸. Resultater opnået her i analysen af haustorium af P. pubera bekræfter denne anbefaling. Med hensyn …

Materials

3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems – ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR – USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR – USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR – USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR – USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos