Micro-CT er et ikke-destruktivt værktøj, der kan analysere plantestrukturer i tre dimensioner. Denne protokol beskriver prøveforberedelsen for at udnytte mikro-CT til at analysere parasitisk plantestruktur og funktion. Forskellige arter bruges til at fremhæve fordelene ved denne metode, når de kombineres med specifikke præparater.
Micro-CT-scanning er blevet et etableret værktøj til at undersøge planters struktur og funktion. Dens ikke-destruktive karakter kombineret med muligheden for tredimensionel visualisering og virtuel sektionering har muliggjort ny og stadig mere detaljeret analyse af komplekse planteorganer. Interaktioner mellem planter, herunder mellem parasitære planter og deres værter, kan også udforskes. Imidlertid bliver prøveforberedelse før scanning afgørende på grund af interaktionen mellem disse planter, som ofte adskiller sig i vævsorganisation og sammensætning. Desuden skal den brede mangfoldighed af parasitiske blomstrende planter, der spænder fra stærkt reducerede vegetative kroppe til træer, urter og buske, overvejes under prøveudtagning, behandling og forberedelse af parasitværtsmateriale. Her beskrives to forskellige tilgange til introduktion af kontrastopløsninger i parasitten og/eller værtsplanterne med fokus på analyse af haustorium. Dette organ fremmer forbindelse og kommunikation mellem de to planter. Efter en simpel tilgang kan detaljer om haustoriumvævsorganisation udforskes tredimensionelt, som vist her for euphytoid-, vin- og misteltenparasitære arter. Valg af specifikke kontrastmidler og anvendelsesmetoder muliggør også detaljeret observation af endoparasitspredning i værtskroppen og påvisning af direkte fartøj-til-fartøj-forbindelse mellem parasit og vært, som vist her for en obligatorisk rodparasit. Således kan protokollen, der diskuteres her, anvendes på den brede mangfoldighed af parasitære blomstrende planter for at fremme forståelsen af deres udvikling, struktur og funktion.
Højopløselig røntgenmikrocomputertomografi (mikro-CT) er en billeddannelsesmetode, hvor flere røntgenbilleder (fremskrivninger) af en prøve registreres fra forskellige synsvinkler og senere bruges til at tilvejebringe en virtuel rekonstruktion af prøven1. Dette virtuelle objekt kan derefter analyseres, manipuleres og segmenteres, hvilket tillader ikke-destruktiv udforskning i tre dimensioner2. Oprindeligt designet til medicinske analyser og senere til industrielle applikationer, giver mikro-CT også fordelen ved at visualisere indre organer og væv uden behov for invasive procedurer3. Ligesom andre former for billeddannelse arbejder mikro-CT med en afvejning mellem synsfeltet og pixelstørrelsen, hvilket betyder, at billeddannelse i høj opløsning af store prøver er næsten uopnåelig4. Der gøres konstant fremskridt inden for brug af røntgenkilder med høj energi (dvs. synkrotron) og sekundær optisk forstørrelse, hvilket gør det muligt for den mindste opløsning at nå under 100 nm 5,6. Ikke desto mindre er længere scanningstider nødvendige for store prøver, hvilket øger chancen for artefakter på grund af prøvebevægelse eller deformation inde i scanneren. Desuden er mikro-CT generelt begrænset af naturlige densitetsvariationer i prøven, og hvordan prøven interagerer med røntgenstråler. Mens en højere røntgendosis er bedst til at trænge ind i tættere prøver, er den mindre effektiv til at fange variationer i densitet inden for og mellem prøven og dens omgivende medium7. På den anden side giver en lavere røntgendosis mindre penetrationskraft og kræver ofte længere scanningstider, men mere følsomhed i densitetsdetektion7.
Disse begrænsninger har længe hæmmet brugen af mikrotomografi til plantevidenskab, da de fleste plantevæv består af let (ikke-tæt) væv med lav røntgenabsorption8. De første anvendelser af mikro-CT var fokuseret på kortlægning af rodnetværk inden for jordmatrixen 9,10. Senere begyndte plantestrukturer med mere signifikante forskelle i vævstæthed, såsom træ, at blive udforsket. Dette har muliggjort undersøgelser af xylemfunktionalitet11,12, udvikling af komplekse vævsorganisationer 13,14 og interaktioner mellem planter15,16,17. Analysen af blødt og homogent væv bliver udbredt på grund af kontrastmidler, som nu er standardprocedure i forberedelser til mikro-CT-scanning af planteprøver. Protokoller til kontrastintroduktion kan dog have forskellige resultater afhængigt af prøvevolumen, strukturelle egenskaber og den anvendte opløsningstype8. Ideelt set bør kontrastmidlet øge sondringen mellem forskellige væv, muliggøre evaluering af vævs-/organfunktionalitet og/eller give biokemisk information om et væv18. Derfor bliver tilstrækkelig prøvebehandling, forberedelse og montering før scanning afgørende for enhver mikro-CT-analyse.
Micro-CT af den parasitære plante haustorium
Parasitiske blomstrende planter repræsenterer en særskilt funktionel gruppe af angiospermer karakteriseret ved et organ kendt som haustorium19. Dette flercellede organ, en udviklingshybrid mellem en modificeret stamme og en rod, virker på værtens fastgørelse, penetration og kontakt med en parasit20. Af denne grund anses haustoriet for at “legemliggøre selve ideen om parasitisme blandt planter”21. En detaljeret forståelse af dette organs udvikling, struktur og funktion er afgørende for parasitisk planteøkologi, evolution og ledelsesstudier. Ikke desto mindre hindrer parasitiske planters overordnede kompleksitet og stærkt modificerede struktur og haustoria ofte detaljeret analyse og sammenligning. Haustoriumforbindelser er normalt også omfattende og ikke homogene i vævs- og cellefordeling (figur 1). I denne sammenhæng, mens arbejde med små vævsfragmenter tillader lettere manipulation og højere opløsning, kan det føre til fejlagtige konklusioner om den tredimensionale arkitektur af komplekse strukturer, såsom det parasitære plantehaustorium.
Selvom der findes en omfattende litteratur om haustoriumanatomi og ultrastruktur for de fleste parasitære plantearter, er den tredimensionelle organisation og det rumlige forhold mellem parasit og værtsvæv stadig dårligt udforsket17. I et nyligt arbejde af Masumoto et al.22 blev over 300 serielle halvtynde mikrotomsektioner afbildet og rekonstrueret til et tredimensionelt virtuelt objekt, der repræsenterer haustorium af to parasitarter. Denne metodes fremragende detaljeringsgrad giver hidtil uset indsigt i haustoriets cellulære og anatomiske 3D-struktur. En sådan tidskrævende teknik ville imidlertid forbyde en lignende analyse i parasitter med mere omfattende haustoriumforbindelser. Anvendelsen af mikro-CT fremstår som et glimrende værktøj til tredimensionel analyse af komplekse og ofte omfangsrige haustoria af parasitære planter. Selvom det ikke er en erstatning for detaljeret anatomisk sektionering og andre komplementære former for mikroskopianalyser17,23, kan resultater opnået via mikro-CT-scanning, især for store prøver, også tjene som vejledning til at styre delprøveudtagningen af mindre segmenter, som derefter kan analyseres ved hjælp af andre værktøjer, såsom konfokal og elektronmikroskopi, eller genanalyseres med mikro-CT-systemer med høj opløsning.
Figur 1: Parasitære planter af forskellige funktionelle grupper, der anvendes i denne protokol. Euphytoid parasit Pyrularia pubera (A), endoparasit Viscum minimum (B) med grønne frugter (stiplet sort cirkel), parasitisk vin Cuscuta americana (C), mistelten Struthanthus martianus (D), obligatorisk rodparasit Scybalium fungiforme (E). Segmenter af værtsroten (Hr) eller stammen (Hs) letter anvendelsen af kontrast i parasithaustorium (P). Tilstedeværelsen af parasitmoderrod/-stamme (pile) i prøven muliggør analyse af haustoriumbeholdernes organisation. Rektangler angiver segmenter af prøven, der anvendes til analyse. Vægtstænger = 2 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Da mikro-CT bliver en stadig mere populær teknik inden for plantevidenskab, er der vejledninger, protokoller og litteratur, der beskæftiger sig med prøvescanning, tredimensionel rekonstruktion, segmentering og analyse 3,10,24. Således vil disse trin ikke blive diskuteret her. Som med enhver fantasiteknik er passende behandling og montering af prøver en grundlæggende, omend ofte en overset procedure. Af denne grund fokuserer denne protokol på forberedelse af haustoriumprøver til mikro-CT-scanning. Mere specifikt beskriver denne protokol to tilgange til introduktion af kontrastmidler i haustoriumprøver for at forbedre visualiseringen af forskellige væv og celletyper i haustorium, for at lette påvisningen af parasitisk væv i værtsroden/stammen og for at analysere parasit-vært vaskulære forbindelser i tre dimensioner. De her beskrevne præparater kan også tilpasses analysen af andre plantestrukturer.
Fem arter blev brugt til bedre at illustrere bekvemmeligheden ved den her beskrevne protokol. Hver art repræsenterer en af de fem funktionelle grupper af parasitære blomstrende planter og adresserer således specifikke punkter relateret til hver gruppes funktionalitet. Pyrularia pubera (Santalaceae) blev valgt til at repræsentere euphytoide parasitter, som spirer i jorden og danner flere haustoria, der forbinder parasitten med rødderne af sine værter25. Haustoria skabt af disse planter er ofte spinkle og let revet fra hinanden fra værten26 (figur 1A), hvilket kræver en mere delikat håndteringsproces. Endoparasitter er repræsenteret her af Viscum minimum (Viscaceae). Arter i denne funktionelle gruppe er kun synlige uden for deres værters krop i korte perioder (figur 1B) og lever det meste af deres livscyklus som signifikant reducerede og mycellignende cellestrenge indlejret i værtsvæv25. En tredje funktionel gruppe omfatter parasitære vinstokke, der spirer på jorden, men kun danner rudimentære rødder, der er afhængige af flere haustoria, der fastgøres til stænglerne af værtsplanter25 (figur 1C). Her er denne funktionelle gruppe repræsenteret af Cuscuta americana (Convolvulaceae). I modsætning til parasitære vinstokke spirer mistelten direkte på grenene på deres værtsplanter og udvikler enten flere eller ensomme haustoria25. Den art, der er valgt til at illustrere denne funktionelle gruppe, er Struthanthus martianus (Loranthaceae), som danner forskellige forbindelser med værtsgrenen (figur 1D). Analyse af ensom mistelten haustoria ved hjælp af en kombination af mikro-CT og lysmikroskopi findes i Teixeira-Costa & Ceccantini17. Endelig omfatter obligatoriske rodparasitter arter, der spirer på jorden og trænger ind i værtsplanternes rødder, som de er helt afhængige af fra de tidligste vækststadier25. Disse planter er her repræsenteret af Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), som producerer store knoldlignende haustoria (figur 1E).
Alle planteprøver, der blev anvendt i denne protokol, blev fastgjort i en 70% formalin eddikesyrealkohol (FAA 70). Fiksering ved prøvetagning er afgørende for at bevare plantevæv, især hvis der er behov for efterfølgende anatomiske analyser. I tilfælde af parasitisk plantehaustorium er fiksering også afgørende, da dette organ ofte primært består af ikke-lignificerede parenkymceller20. Detaljerede protokoller for fiksering af plantevæv, herunder fremstilling af fikseringsopløsninger, findes andetsteds27. På den anden side kan fikseringsmidler i større eller mindre grad forårsage ændringer i en prøves fysiske og kemiske egenskaber, hvilket gør den uegnet til specifikke biomekaniske og histokemiske analyser. Således kan friske prøver, dvs. ikke-fikseret materiale indsamlet umiddelbart før tilberedning, også anvendes med denne protokol. Detaljer om, hvordan man håndterer nye prøver og fejlfindingsforslag til fikseret materiale, findes i diskussionsafsnittet.
Brugen af tungmetalopløsninger til forbedring af plantevævskontrast er blevet et afgørende skridt i prøveforberedelse til mikro-CT-analyse. Flere forbindelser, der almindeligvis er tilgængelige i plantemikromorfologilaboratorier, er blevet testet af Staedler et al., Der anbefaler at bruge phosphotungstate som det mest effektive middel til penetrerende prøver og øge kontrastindeks8. Resultater opnået her i analysen af haustorium af P. pubera bekræfter denne anbefaling. Med hensyn …
The authors have nothing to disclose.
Jeg vil gerne takke Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brasilien) og Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) for deres altoverskyggende hjælp og uundværlige brugeruddannelse til forskellige mikrotomografisystemer og dataanalysesoftware. Jeg takker også personalet på EEB Greenhouse ved University of Connecticut (USA), især Clinton Morse og Matthew Opel for at levere eksemplarerne af Viscum minimum. Dr. John Wenzel gav mulighed for og stor hjælp til prøveudtagning af Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao og Talitha Motta hjalp meget med prøveudtagning af Scybalium fungiforme. Ariadne Furtado og Dr. Fernanda Oliveira og Maria Aline Neves leverede referencen for brugen af phloxin B til analyse af endofytiske svampe. Videooptagelse på Vrije Universiteit Brussel blev muliggjort ved hjælp af Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka og Dr. Harry Olde Venterink. Finansieringen blev ydet af koordineringen til forbedring af personalet på de videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) og Harvard University Herbaria (USA).
3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |