Использование микро-КТ-сканирования для анализа паразитических взаимодействий между растением и хозяином
Summary
Микро-КТ – это неразрушающий инструмент, который может анализировать структуры растений в трех измерениях. В настоящем протоколе описана пробоподготовка с использованием микро-КТ для анализа структуры и функции паразитарных растений. Различные виды используются, чтобы подчеркнуть преимущества этого метода в сочетании с конкретными препаратами.
Abstract
Микро-КТ-сканирование стало признанным инструментом для исследования структуры и функции растений. Его неразрушающий характер в сочетании с возможностью трехмерной визуализации и виртуального разреза позволил по-новому и все более детально анализировать сложные органы растений. Также могут быть изучены взаимодействия между растениями, в том числе между растениями-паразитами и их хозяевами. Однако подготовка образца перед сканированием становится решающей из-за взаимодействия между этими растениями, которые часто различаются по организации и составу тканей. Кроме того, при отборе проб, обработке и подготовке материала паразита-хозяина необходимо учитывать широкое разнообразие паразитических цветковых растений, начиная от сильно редуцированных вегетативных тел и заканчивая деревьями, травами и кустарниками. Здесь описаны два различных подхода к введению контрастных растворов в растения-паразиты и/или растения-хозяева, уделяя особое внимание анализу гаустория. Этот орган способствует связи и общению между двумя растениями. Следуя простому подходу, детали организации ткани гаустория могут быть исследованы в трех измерениях, как показано здесь для видов эуфотоидов, виноградной лозы и омелы. Выбор специфических контрастных агентов и подходов к применению также позволяет детально наблюдать за распространением эндопаразита в организме хозяина и обнаруживать прямую связь между сосудами и хозяином, как показано здесь для облигатного корневого паразита. Таким образом, обсуждаемый здесь протокол может быть применен к широкому разнообразию паразитических цветковых растений для улучшения понимания их развития, структуры и функционирования.
Introduction
Рентгеновская микрокомпьютерная томография высокого разрешения (микро-КТ) представляет собой метод визуализации, при котором несколько рентгенограмм (проекций) образца записываются под разными углами обзора и в дальнейшем используются для обеспечения виртуальной реконструкции образца1. Затем этот виртуальный объект можно анализировать, манипулировать и сегментировать, что позволяет проводить неразрушающее исследование в трех измерениях2. Первоначально разработанная для медицинских анализов, а затем для промышленного применения, микро-КТ также предлагает преимущество визуализации внутренних органов и тканей без необходимости инвазивных процедур3. Как и другие формы визуализации, микро-КТ работает с компромиссом между полем зрения и размером пикселя, что означает, что визуализация больших образцов с высоким разрешением практически недостижима4. Постоянно делаются успехи в использовании высокоэнергетических источников рентгеновского излучения (например, синхротрона) и вторичного оптического увеличения, что позволяет наименьшему разрешению достигать менее 100 нм 5,6. Тем не менее, для больших образцов требуется более длительное время сканирования, что увеличивает вероятность появления артефактов из-за движения или деформации образца внутри сканера. Кроме того, микро-КТ обычно ограничена естественными изменениями плотности в образце и тем, как образец взаимодействует с рентгеновскими лучами. В то время как более высокая доза рентгеновского излучения лучше всего подходит для проникновения в более плотные образцы, она менее эффективна для улавливания изменений плотности внутри и между образцом и окружающей его средой7. С другой стороны, меньшая доза рентгеновского излучения обеспечивает меньшую проникающую способность и часто требует более длительного времени сканирования, но большей чувствительности при обнаружении плотности7.
Эти ограничения долгое время препятствовали использованию микротомографии в науках о растениях, учитывая, что большинство растительных тканей состоят из легкой (неплотной) ткани с низким поглощением рентгеновского излучения8. Первые применения микро-КТ были сосредоточены на картировании корневых сетей в почвенной матрице 9,10. Позже стали исследоваться растительные структуры с более значительными различиями в плотности тканей, такие как древесина. Это позволило исследовать функциональность ксилемы 11,12, развитие сложных тканевых организаций13,14 и взаимодействия между растениями15,16,17. Анализ мягких и однородных тканей получает широкое распространение благодаря контрастным веществам, которые в настоящее время являются стандартной процедурой при подготовке к микро-КТ-сканированию образцов растений. Однако протоколы введения контраста могут иметь разные результаты в зависимости от объема образца, структурных свойств и типа используемого раствора8. В идеале контрастное вещество должно усиливать различие между различными тканями, позволять оценивать функциональность ткани/органа и/или предоставлять биохимическую информацию о ткани18. Таким образом, адекватная обработка, подготовка и монтаж образца перед сканированием приобретают решающее значение для любого микро-КТ-анализа.
Микро-КТ паразитического растения гаустория
Паразитические цветковые растения представляют собой отдельную функциональную группу покрытосеменных растений, характеризующихся органом, известным как гаусторий19. Этот многоклеточный орган, являющийся гибридом развития между модифицированным стеблем и корнем, воздействует на прикрепление, проникновение и контакт паразита20 с хозяином. По этой причине считается, что гаусторий «воплощает саму идею паразитизма среди растений»21. Детальное понимание развития, структуры и функционирования этого органа имеет решающее значение для изучения экологии, эволюции и управления паразитическими растениями. Тем не менее, общая сложность паразитических растений и сильно измененная структура и гаустория часто препятствуют детальному анализу и сравнению. Гаусторийные связи также обычно обширны и неоднородны по распределению тканей и клеток (рис. 1). В этом контексте, хотя работа с небольшими фрагментами тканей позволяет легче манипулировать и иметь более высокое разрешение, это может привести к ошибочным выводам о трехмерной архитектуре сложных структур, таких как паразитический гаусторий растений.
Несмотря на то, что существует обширная литература по анатомии и ультраструктуре гаустория для большинства видов растений-паразитов, трехмерная организация и пространственные отношения между тканями паразита и хозяина остаются плохо изученными17. В недавней работе Masumoto et al.22 более 300 серийных полутонких срезов микротома были изображены и реконструированы в трехмерный виртуальный объект, представляющий гаусторий двух видов паразитов. Превосходный уровень детализации этого метода обеспечивает беспрецедентное понимание клеточной и анатомической 3D-структуры гаустория. Однако такой трудоемкий метод запретил бы аналогичный анализ у паразитов с более обширными гаусторийными связями. Использование микро-КТ становится отличным инструментом для трехмерного анализа сложных и часто громоздких гаусторий растений-паразитов. Несмотря на то, что результаты, полученные с помощью микро-КТ-сканирования, особенно для больших образцов, не заменяют подробное анатомическое срезирование и другие дополнительные формы микроскопического анализа17,23, они также могут служить руководством для направления субвыборки более мелких сегментов, которые затем могут быть проанализированы с использованием других инструментов, таких как конфокальная и электронная микроскопия, или повторно проанализированы с помощью систем микро-КТ с высоким разрешением.
Рисунок 1: Паразитические растения различных функциональных групп, используемые в этом протоколе. Эуфитоидный паразит Pyrularia pubera (A), эндопаразит Viscum minimum (B) с зелеными плодами (пунктирный черный круг), паразитическая лиана Cuscuta americana (C), омела Struthanthus martianus (D), облигатный корневой паразит Scybalium fungiforme (E). Сегменты корня хозяина (Hr) или стебля (Hs) облегчают применение контраста в гаустории паразита (P). Наличие в образце материнского корня/стебля паразита (стрелки) позволяет проанализировать организацию сосуда гаустория. Прямоугольниками обозначены сегменты образца, используемого для анализа. Масштабные линейки = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
По мере того, как микро-КТ становится все более популярным методом в науках о растениях, существуют руководства, протоколы и литература, посвященные сканированию образцов, трехмерной реконструкции, сегментации и анализу 3,10,24. Таким образом, эти шаги здесь обсуждаться не будут. Как и в случае с любой техникой воображения, надлежащая обработка и монтаж образцов являются фундаментальной, хотя и часто упускаемой из виду процедурой. По этой причине этот протокол фокусируется на подготовке образцов гаустория для микро-КТ-сканирования. Более конкретно, этот протокол описывает два подхода к введению контрастных веществ в образцы гаустория для улучшения визуализации различных тканей и типов клеток в гаустории, для облегчения обнаружения паразитарной ткани в корне / стебле хозяина и для анализа сосудистых связей паразит-хозяин в трех измерениях. Препараты, описанные здесь, также могут быть адаптированы для анализа других структур растений.
Пять видов были использованы, чтобы лучше проиллюстрировать удобство протокола, описанного здесь. Каждый вид представляет одну из пяти функциональных групп паразитических цветковых растений, тем самым обращаясь к конкретным моментам, связанным с функциональностью каждой группы. Pyrularia pubera (Santalaceae) была выбрана для представления эуфитоидных паразитов, которые прорастают в землю и образуют множественные гаустории, которые соединяют паразита с корнями его хозяев25. Гаустории, создаваемые этими растениями, часто разрежены и легко отрываются от хозяина26 (рис. 1А), что требует более деликатного процесса обращения. Эндопаразиты представлены здесь Viscum minimum (Viscaceae). Виды этой функциональной группы видны вне тела своих хозяев только в течение коротких периодов времени (рис. 1B) и живут большую часть своих жизненных циклов в виде значительно редуцированных и мицелиальноподобных нитей клеток, встроенных в ткани хозяина25. Третья функциональная группа включает паразитические лианы, которые прорастают на земле, но образуют только рудиментарные корни, опираясь на множественные гаустории, которые прикрепляются к стеблям растений-хозяев25 (рис. 1С). Здесь эта функциональная группа представлена Cuscuta americana (Convolvulaceae). В отличие от паразитических лиан, омела прорастает непосредственно на ветвях растений-хозяев и развивает либо множественную, либо одиночную гаусторию25. Видом, выбранным для иллюстрации этой функциональной группы, является Struthanthus martianus (Loranthaceae), который образует различные связи с ветвью хозяина (рис. 1D). Анализ одиночной гаустории омелы с использованием комбинации микро-КТ и световой микроскопии можно найти в Teixeira-Costa & Ceccantini17. Наконец, облигатные корневые паразиты включают виды, которые прорастают на земле и проникают в корни растений-хозяев, от которых они полностью зависят с самых ранних стадий роста25. Эти растения представлены здесь Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), которые производят крупные клубневидные гаустории (рис. 1E).
Все образцы растений, использованные в этом протоколе, были зафиксированы в 70% спирте формалиновой уксусной кислоты (FAA 70). Фиксация при отборе проб имеет решающее значение для сохранения растительных тканей, особенно если необходимы последующие анатомические анализы. В случае паразитического гаустория растений фиксация также необходима, так как этот орган часто в основном состоит из неодревесневших клеток паренхимы20. Подробные протоколы фиксации растительной ткани, включая приготовление фиксирующих растворов, можно найти в другом месте27. С другой стороны, в большей или меньшей степени фиксаторы могут вызывать изменения физических и химических свойств образца, делая его непригодным для конкретных биомеханических и гистохимических анализов. Таким образом, свежие образцы, т.е. нефиксированный материал, собранный непосредственно перед подготовкой, также могут быть использованы с этим протоколом. Подробная информация о том, как работать со свежими образцами, и предложения по устранению неполадок с фиксированным материалом приведены в разделе обсуждения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование растворов тяжелых металлов для улучшения контраста тканей растений стало важным шагом в подготовке образцов для микро-КТ-анализа. Несколько соединений, обычно доступных в лабораториях микроморфологии растений, были протестированы Staedler et al., которые рекомендуют использ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я хотел бы поблагодарить д-ра Симону Гомес Феррейру (Лаборатория микротомографии, Университет Сан-Паулу, Бразилия) и д-ра Грега Лина (Центр наноразмерных систем, Гарвардский университет, США) за их первостепенную помощь и незаменимую подготовку пользователей для работы с различными системами микротомографии и программным обеспечением для анализа данных. Я также благодарю сотрудников EEB Greenhouse в Университете Коннектикута (США), особенно Клинтона Морса и Мэтью Опеля за предоставление образцов минимума Viscum. Д-р Джон Венцель предоставил возможность и большую помощь в отборе проб Pyrularia pubera. Магистры наук Каролина Бастос, магистр наук Ясмин Хирао и Талита Мотта очень помогли с отбором проб Scybalium fungiforme. Магистр наук Ариадна Фуртадо и доктора Фернанда Оливейра и Мария Алин Невес предоставили ссылку на использование флоксина B для анализа эндофитных грибов. Видеозапись в Vrije Universiteit Brussel стала возможной благодаря помощи доктора Филиппа Клэйса, доктора Кристофа Сноука, магистра наук Джейка Гриффита, доктора Барабары Веселки и доктора Гарри Олде Вентеринка. Финансирование осуществлялось Координационным центром по совершенствованию кадров высших учебных заведений (CAPES, Бразилия) и Гербарием Гарвардского университета (США).
Materials
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems – ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR – USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR – USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR – USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR – USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
References
- Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
- Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
- Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
- Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
- Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
- Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
- Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
- da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
- Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
- Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface – Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
- Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
- Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
- Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
- Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
- Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
- Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains’ morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
- Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
- Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world’s largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
- Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
- Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
- Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
- Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
- Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).
