Méthode de double coloration pour détecter la pectine dans l’interaction plante-champignon

Résumé

Ce protocole décrit une méthode microscopique pour détecter la pectine dans l’interaction café-champignon.

Résumé

Les cellules végétales utilisent différents mécanismes structurels, constitutifs ou inductibles, pour se défendre contre les infections fongiques. L’encapsulation est un mécanisme inductible efficace pour isoler l’haustoria fongique du protoplaste des cellules végétales. Inversement, la pectine, l’un des composants polymères de la paroi cellulaire, est la cible de plusieurs enzymes pectolytiques dans les interactions nécrotrophes. Ici, un protocole pour détecter la pectine et les hyphes fongiques par microscopie optique est présenté. L’encapsulation riche en pectine dans les cellules des feuilles de café infectées par le champignon de rouille Hemileia vastatrix et la modification de la paroi cellulaire mésophylle induite par Cercospora coffeicola sont étudiées . Les échantillons de feuilles lésionnées ont été fixés avec la solution de Karnovsky, déshydratés et incorporés dans du méthacrylate de glycol pendant 2 à 4 jours. Toutes les étapes ont été suivies par pompage sous vide pour éliminer l’air dans les espaces intercellulaires et améliorer le processus d’intégration. Les blocs incorporés ont été sectionnés en sections de 5 à 7 μm d’épaisseur, qui ont été déposées sur une lame de verre recouverte d’eau et ensuite chauffées à 40 ° C pendant 30 minutes. Ensuite, les lames ont été doublement colorées avec 5% de bleu de coton dans le lactophénol pour détecter le champignon et 0,05% de ruthénium rouge dans l’eau pour détecter la pectine (groupes acides d’acides polyuroniques de pectine). On a découvert que les haustoria fongiques d’Hemileia vastatrix étaient encapsulées par la pectine. Dans la cercosposporose du café, des cellules mésophylles ont présenté une dissolution des parois cellulaires, et des hyphes intercellulaires et des conidiophores ont été observés. La méthode présentée ici est efficace pour détecter une réponse associée à la pectine dans l’interaction plante-champignon.

Introduction

Les mécanismes de défense de la paroi cellulaire chez les plantes sont cruciaux pour contenir l’infection fongique. Des études ont rapporté des changements dans l’épaisseur et la composition de la paroi cellulaire depuis le^19ème siècle ^1,2. Ces changements peuvent être induits par un agent pathogène fongique qui stimule la formation d’une papille, ce qui empêche les champignons d’entrer dans la cellule ou pourrait être utilisé pour encapsuler les hyphes afin d’isoler le protoplaste de la cellule hôte de l’haustoria fongique. La production d’une barrière dynamique de la paroi cellulaire (c.-à-d. papi....

Protocole

1. Préparation de la solution tampon et des réactifs

1. Préparer un tampon de cacodylate de 2 M en ajoutant 4,28 g de cacodylate de sodium à 100 mL d’eau distillée et ajuster le pH à 7,25 avec 0,2 N HCl.
2. Préparer 100 mL de la solution fixative de Karnovsky en mélangeant 10 mL de glutaraldéhyde aqueux à 25 %, 10 mL de formaldéhyde aqueux à 10 %, 25 mL de tampon cacodylate 2 M et 0,5 mL de CaCl_{2 26} à ^0,5 M. Porter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée.
   REMARQUE: La solution peut être conservée au réfrigérateur pendant 6 mois.
   ATTENTION : La solution tampon de cacodylate est toxique; par cons....

Résultats

La coloration au lactophénol bleu coton sur la section incorporée au GMA a révélé la présence de plusieurs structures fongiques entre et à l’intérieur des cellules mésophylles du café dans les interactions fongiques biotrophes et nécrotrophes.

Dans le pathosystème biotrophique, lorsqu’il est coloré à l’aide de la méthode de double coloration, les hyphes d’Hemileia vastatrix contenant des parois cellulaires et la teneur dense en protoplastes apparaissent en bleu foncé dans le parenchym.......

Discussion

Le présent travail introduit un test histochimique alternatif à double coloration pour étudier la composition en pectine des parois cellulaires qui encapsule l’haustoria dans un pathosystème biotrophique. L’objectif est également de démontrer l’efficacité de la méthode pour détecter les champignons nécrotrophes et les changements de paroi cellulaire induits par celui-ci. Ici, la pectine des parois cellulaires du parenchyme du café peut encapsuler à la fois le cou et l’haustorium du champignon de rouille Hemileia vast.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames DB80 HS	Leica	14035838383	Section
Cacodylate tampon	EMS	# 11652	Fixation
Coton Bleu Lactophénol	Metaquí ; mica	70SOLSIG024629	Coloration
Formaldéhyde	EMS#	15712	Fixation
Glutaraldéhyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS#	14653	Historesin pour l’encastrement
Plaque chauffante	Dubesser	SSCD25X30-110V	Coloration
Microscopie	Zeiss	#490040-0030-000	Capture d’image
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectionnement
Moulage en plastique Plateau de gobelet	EMS	10176-30	Coloration
rouge ruthénium	LABHouse	#006004	Logiciel de coloration
Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Capture d’image
Pompe à vide	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	fixation