تقنية جراحية معدلة لزراعة الكلى في الفئران
Summary
يقدم هذا البروتوكول تقنية جراحية جديدة لزراعة كلى الفئران مع التركيز على استراتيجية مفاغرة شريانية معدلة. كما يتم تقديم تقنية خياطة الأوعية الدموية بما في ذلك طريقة بسيطة وأكثر أمانا لمفاغرة الحالب والمثانة. هذه التعديلات تقصر وقت العملية وتحسن معدل نجاح عملية زرع الكلى بالفئران.
Abstract
زرع الكلى في الفئران هو إجراء جراحي معقد وصعب. وهناك عدد قليل جدا من المنشورات التي تبين الخطوات الرئيسية لهذه العملية. لذلك ، تقدم هذه المقالة التقنية وتشير إلى المحاذير الجراحية المرتبطة بهذه العملية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح تعديلات مهمة مقارنة بالإجراء التقليدي. أولا ، يتم قطع رقعة من الشريان الأورطي البطني وإعدادها بحيث يتم نقل التشعبات القريبة من الشريان الكلوي ، بما في ذلك الشريان الحالبي مع الكلى المانحة في كتلة. هذا يقلل من خطر نخر الحالب ويتجنب تطور انسداد المسالك البولية. ثانيا ، تم إثبات طريقة جديدة لمفاغرة الأوعية الدموية تسمح للمشغل بزيادة أو تقليل حجم المفاغرة بمرونة بعد بدء تروية زرع الكلى بالفعل. هذا يتجنب تطور تضيقات الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. ثالثا ، يتم عرض تقنية تمكن من مفاغرة الحالب المانح الحساس والمثانة المتلقية التي لا تسبب صدمة. يمكن أن يؤدي اعتماد هذا البروتوكول إلى تقصير وقت التشغيل وتقليل الضرر الذي يلحق بمثانة المتلقي ، وبالتالي زيادة كبيرة في معدل نجاح العملية للفئران المتلقية.
Introduction
منذ أن طور Sakowitz et al. نماذج الفئران لزرع الكلى في عام 1973 لأول مرة1 ، فقد ثبت أنه أداة تجريبية مهمة لدراسة آليات الإصابة الإقفارية المزروعة والرفض المناعي وكذلك لتطوير علاجات جديدة تهدف إلى إطالة أمد البقاء على قيد الحياة وربما لتحقيق التسامح المناعي. ومع ذلك ، فقد أثبتت التقنية الجراحية أنها معقدة ومتطلبة للغاية ، وأحيانا لها مضاعفات مثل تضيقات مفاغرة الأوعية الدموية التي تؤدي إلى فشل زرع الكلى غير المناعي قبل الكلوي2 ، والفشل الكلوي الناجم عن نقص التروية والنخر اللاحق للحالب المزروع ، وتضيقات مفاغرة الحالب المزروع و / أو المثانة البول لدى المتلقي مما يؤدي إلى اضطراب في تدفق البول. كل هذه هي الأسباب التي تجعل زراعة الكلى في الفئران لم يتم تطويرها بشكل أكبر وبالتالي لا تستخدم على نطاق واسع. لا يزال إنشاء نموذج فعال ومستقر طويل الأجل لزراعة كلى الفئران دون مضاعفات الأوعية الدموية والمسالك البولية له أهمية لا يمكن الاستغناء عنها للعديد من الدراسات في مجال زراعة الأعضاء مع التركيز على المناعة الكلوية بوساطة ولكن أيضا الأمراض المعدية3. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع عمليات زرع الأعضاء الأخرى في نماذج الفئران مثل زراعة الرئة والقلب والأمعاء4,5 ، يوفر نموذج زراعة الكلى للفأر فرصة لدراسة البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل حتى في وضع التباين الرئيسي في مستضد التوافق النسيجي 3,6. وقد تبين أيضا أنه في نفس بيئة مجموعات الإجهاد بين المتبرع والمتلقي ، تتميز عمليات زرع الأعضاء المختلفة مثل القلب أو الكلى بديناميكيات وبداية مختلفة لرفض allograft3. علاوة على ذلك ، من وجهة نظر أمراض الكلى ، فهو نموذج أكثر ملاءمة لدراسة الآليات التنظيمية المناعية بوساطة المتني في سياق أحداث الرفض الحاد والمزمن من تجارب زراعة الجلد البسيطة.
على أساس التقارير السابقة حول التقنية الجراحية لزرع الكلى في الفئران3،7،8،9 ، نوضح هنا التحسينات الموثوقة التالية التي تم تطبيقها بنجاح خلال السنوات العشر الماضية ضمن مجموعتنا 10،11،12: أولا ، يتم الحفاظ على الشريان الحالبي بأمان حيث يتم استئصال الشريان الكلوي في كتلة واحدة. جنبا إلى جنب مع الجزء المعني من الشريان الأورطي البطني. ثانيا ، تقنية جديدة وبسيطة وسريعة لمفاغرة الأوعية الدموية بدون عقدة حيث لا يتم ربط الغرزة النهائية من المفاغرة بنهاية التعادل العلوي مثل النهج التقليدي ولكنها تظل حرة. تمكن هذه التقنية من زيادة أو تقليل حجم المفاغرة بعد التروية الكلوية لتجنب تضيق الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. ثالثا ، تم استخدام إبر حقنة 21 جم و 30 جم كأداة توجيه ثقب مساعدة من أجل زرع الحالب المانح في جدار المثانة المتلقي مما يقلل من الضرر الذي يلحق بالمثانة المتلقي ويسهل تكوين مفاغرة خالية من التضيق.
في هذا التقرير ، قارنا أيضا التقنية التقليدية المستخدمة على نطاق واسع مع التقنية المعدلة التي تم إنشاؤها في مختبرنا ولم نجد فرقا كبيرا في درجة ضمور الكلى الأنبوبي وتليف الأنسجة الخلالية لزرع الكلى. في الدراسات السابقة ، قارنا أيضا نتائج هذه التقنية الجديدة بالطريقة التقليدية من حيث النزيف الموضعي والجلطة ووقت إجراء مفاغرة الأوعية ومعدل البقاء على قيد الحياة. وجدنا تحسينات مثل التخفيضات الكبيرة في أحداث الجلطة المحلية (1.1٪ مقابل 6.6٪) ، وتقليل الوقت لإجراء المفاغرة ، والكسب غير المشروع الجيني للكلى القابل للتكرار على المدى الطويل (95٪ مقابل 84٪ مع النهج الكلاسيكي)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن نموذج زراعة الجلد في الفئران بسيط وسهل الأداء لدراسة أحداث الرفض المناعي ، فقد ثبت أن التقنيات الجراحية للتحقيق بشكل أكثر تحديدا في التغيرات الالتهابية المرتبطة بالمناعة بعد القلب16 وزرع الكلى10 معقدة ومتطلبة للغاية. من وجهة نظر أخصائي أمراض الكلى المزر…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فريق الدكتور تيانتيان باي على المساعدة في التعليق الصوتي ، والآنسة ميان باو على مساعدتها في التوضيح الطبي. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) لتعزيز التعاون الدولي (HO2581/4-1 إلى AH) والمؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC ؛ # 81760291 إلى FJ).
Materials
| 30G-needles | Braun | 456300 | – |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | – |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | – |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | – |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | – |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | – |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | – |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | – |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | – |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | – |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | – |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | – |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | – |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | – |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | – |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | – |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | – |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | – |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | – |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | – |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | – |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | – |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | – |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | – |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | – |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | – |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | – |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | – |
| metamizole | WDT | no catalog numer | – |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | – |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | – |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | – |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | – |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | – |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | – |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | – |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | – |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | – |
| Slides | Servicebio | – | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | – |
| straight forceps | WPI | 14113-G | – |
| surgical tape | BSN | 4120 | – |
| Suture Tying Forceps – 10 cm | FST | 18025-10 | – |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | – |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | – |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | – |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | – |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | – |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | – |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | – |
| xylazine | Bayer | Rompun | – |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | – |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H. Murine kidney transplant technique. Journal of Visualized Experiments. (104), e52848 (2015).
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
