Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.
Abstract
High-content screening (HCS) en high-content analysis (HCA) zijn technologieën die onderzoekers de mogelijkheid bieden om grootschalige kwantitatieve fenotypische metingen uit cellen te extraheren. Deze aanpak is krachtig gebleken voor het verdiepen van ons begrip van een breed scala aan zowel fundamentele als toegepaste gebeurtenissen in de celbiologie. Tot op heden zijn de meeste toepassingen voor deze technologie gebaseerd op het gebruik van cellen die in monolagen zijn gekweekt, hoewel men zich steeds meer realiseert dat dergelijke modellen veel van de interacties en processen die in weefsels plaatsvinden niet samenvatten. Als zodanig is er een opkomst in de ontwikkeling en het gebruik van 3-dimensionale (3D) celassemblages, zoals sferoïden en organoïden. Hoewel deze 3D-modellen bijzonder krachtig zijn in de context van kankerbiologie en medicijnafgiftestudies, vormen hun productie en analyse op een reproduceerbare manier die geschikt is voor HCS en HCA een aantal uitdagingen. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een methode voor het genereren van meercellige tumorsferoïden (MCTS) en toont aan dat het kan worden toegepast op drie verschillende cellijnen op een manier die compatibel is met HCS en HCA. De methode vergemakkelijkt de productie van enkele honderden sferoïden per put, wat het specifieke voordeel biedt dat bij gebruik in een screeningsregime gegevens kunnen worden verkregen uit enkele honderden structuren per put, allemaal op dezelfde manier behandeld. Er worden ook voorbeelden gegeven, die gedetailleerd beschrijven hoe de sferoïden moeten worden verwerkt voor fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie en hoe HCA kwantitatieve kenmerken kan extraheren op zowel het sferoïdeniveau als uit individuele cellen in elke sferoïde. Dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast om een breed scala aan belangrijke vragen in de celbiologie te beantwoorden.
Introduction
Traditioneel worden celgebaseerde assays uitgevoerd in monolagen die groeien op een vast substraat, dat effectief kan worden beschouwd als een tweedimensionale (2D) omgeving. Het wordt echter steeds meer erkend dat 2D-celkweekmodellen in sommige contexten fysiologische relevantie missen en veel van de complexe interacties die tussen cellen optreden niet kunnen repliceren1. Driedimensionale (3D) celkweekmethoden worden snel populair onder onderzoekers en 3D-celmodellen tonen een hoog potentieel om de fysiologische omstandigheden die cellen in de weefselomgeving tegenkomen beter na te bootsen2. Er zijn verschillende soorten 3D-celassemblages die zijn gebruikt, maar de twee meest voorkomende typen zijn sferoïden en organoïden. Sferoïden kunnen uit veel verschillende cellijnen worden gekweekt en ze kunnen verschillende vormen en maten aannemen, afhankelijk van het gebruikte celtype en hun assemblagemethode3. Bovendien kunnen sferoïden ook worden aangeduid als meercellige tumorsferoïden (MCTS) wanneer ze worden gekweekt uit kankercellijnen, en deze modellen hebben een bijzonder gebruik gevonden voor preklinische in vitro medicijnafgifte en toxiciteitsstudies4,5. Organoïden daarentegen zijn bedoeld om de weefsels en organen in ons lichaam beter na te bootsen en kunnen complexere morfologische arrangementen aannemen. De productie van organoïden omvat het gebruik van volwassen stamcellen of pluripotente stamcellen, die kunnen worden geherprogrammeerd in de juiste cellen om op het weefsel of orgaan van belang te lijken. Ze worden voornamelijk gebruikt om de ontwikkeling van organen te onderzoeken en om ziekten en gastheer-pathogeen interacties te modelleren6.
Er is een reeks verschillende methoden die worden gebruikt om 3D-celassemblages te genereren. Steigergebaseerde methoden bieden een substraat of ondersteuning waaraan cellen zich kunnen hechten of erin kunnen groeien. Deze steigers kunnen verschillende vormen hebben en kunnen gemaakt worden van verschillende materialen. De meest voorkomende zijn extracellulaire matrix (ECM) componenten en hydrogels, en ze zijn ontworpen om te lijken op de natuurlijke extracellulaire omgeving van cellen en daardoor fysiologische interacties te vergemakkelijken4,7. ECM-keldermateriaal is geëxtraheerd uit engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomtumor en heeft aangetoond dat het een rijk mengsel van ECM-componenten bevat, waaronder laminine, type IV collageen en perlecan8. Ondanks de voordelige samenstelling zijn er echter twee belangrijke uitdagingen met betrekking tot het gebruik ervan, namelijk de batch-to-batch variabiliteit en dat het twee verschillende aggregaattoestanden heeft onder en boven 10 °C8,9. Hydrogels hebben daarentegen het voordeel dat ze flexibel zijn met betrekking tot hun componenten en stijfheid, en ze kunnen worden aangepast aan de specifieke gewenste 3D-celassemblage7,10. Scaffold-gebaseerde methoden zijn essentieel voor organoïde groei, maar worden ook veel gebruikt voor sferoïden. Steigervrije methoden, die werken door te voorkomen dat cellen zich hechten aan het oppervlak waarop ze groeien, zijn meestal alleen compatibel met sferoïde assemblage. Voorbeelden hiervan zijn ultra-low attachment (ULA) platen, met een platte bodem of U-bodem, die aggregatie van de cellen tot sferoïden mogelijk maken, of het gebruik van continue agitatie van de cellen in spinner/ rotatiekolven10.
Het gebruik van 3D-celassemblages om een breed scala aan biologische gebeurtenissen te bestuderen, wint snel aan populariteit; het is echter van essentieel belang dat de voor hun cultuur gekozen methode geschikt en verenigbaar is met de plannen voor hun downstream-analyse. Het gebruik van ULA-platen genereert bijvoorbeeld sferoïden met een hoge consistentie; deze methode is echter beperkt tot de productie van een enkele sferoïde per put, waardoor de doorvoer wordt beperkt. Bijzondere aandacht is nodig wanneer fluorescentiebeeldvorming van de 3D-structuur wordt gepland. Het substraat of de plaat waarop de assemblage wordt gekweekt, moet optisch compatibel zijn en er moet voor worden gezorgd dat de effecten van lichtverstrooiing veroorzaakt door eventuele steigers die mogelijk zijn gebruikt, worden geminimaliseerd11. Dit specifieke probleem wordt acuter naarmate het numerieke diafragma van de microscoop objectieflenzen toeneemt.
Misschien wel een van de belangrijkste redenen om ervoor te kiezen om met een 3D-celmodel te werken, is om volumetrische beeldvormingsgegevens te extraheren over niet alleen de hele assemblage, maar ook over de individuele cellen erin. McTS-modellen, in het bijzonder, beginnen zeer krachtig te blijken voor het verdiepen van ons begrip van hoe therapeutica van buitenaf naar centrale cellen gaan (zoals ze nodig zouden hebben in een tumor)12, en dus is het verkrijgen van kennis van individuele cellen op verschillende lagen essentieel. De beeldvormingstechnologie die kwantitatieve informatie uit individuele cellen haalt, wordt high-content analysis (HCA) genoemd en is een krachtige aanpak in de context van screening13. Tot op heden is HCA bijna uitsluitend toegepast op monolaagculturen, maar er is een toenemend besef dat deze benadering de kracht heeft om te worden toegepast op 3D-culturen, waardoor een breed scala aan cellulaire functies en processen kan worden bestudeerd14. Het zou het duidelijke voordeel hebben dat grote aantallen 3D-assemblages kunnen worden geanalyseerd, waardoor mogelijk gegevens op celniveau van elke structuur kunnen worden geleverd. Uitdagingen in verband met beeldvorming van potentieel dikke celassemblages, evenals de grote gegenereerde datasets, moeten echter worden overwonnen.
In dit artikel wordt een robuuste steigergebaseerde methode gepresenteerd voor de grootschalige productie van MCTS in een 96-well formaat. De methode vergemakkelijkt de productie van enkele honderden 3D-celassemblages in elke put. Voorbeelden worden getoond voor drie verschillende celtypen, die solide tumormodellen van de lever, longen en dikke darm vertegenwoordigen. De sferoïden die zich vormen kunnen van verschillende grootte zijn, en dus wordt HCA gebruikt om structuren van een bepaalde grootte en / of morfologie te selecteren. Deze functie biedt het extra voordeel dat alle waargenomen fenotypen kunnen worden vergeleken tussen sferoïden van verschillende grootte, maar allemaal op dezelfde manier in dezelfde put worden behandeld. Deze aanpak is compatibel met beeldvorming met hoge resolutie en levert zowel kwantitatieve gegevens op celniveau als op subcellulair niveau van dezelfde cellulaire assemblages. Deze methode van sferoïde productie heeft het bijkomende voordeel ten opzichte van methoden die een enkele sferoïde per put genereren, dat de grote aantallen sferoïden die in elke put worden geproduceerd, mogelijk voldoende biomassa leveren voor andere stroomafwaartse analyses, zoals transcriptoom- en proteoomprofilering.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven aanpak beschrijft een platform voor het genereren van enkele honderden sferoïden per put op een manier die geschikt is voor HCS en HCA. In vergelijking met andere populaire methoden, zoals het gebruik van platbodem- en ULA-platen met ronde bodem, die de vorming van slechts één sferoïde per put mogelijk maken18,19, biedt deze methode de mogelijkheid om informatie met hoge resolutie te extraheren uit grote aantallen sferoïden in een screenin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van een infrastructuuronderzoekssubsidie van Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) aan JCS. Het werk in het UCD Cell Screening Laboratory wordt ondersteund door het UCD College of Science. ASC wordt gefinancierd door een Irish Research Council (IRC) Government of Ireland Postgraduate Scholarship (GOIPG / 2019 / 68). De auteurs bedanken ook alle leden van het lab voor hun input en nuttige discussies. Het kunstwerk in figuur 1 is gegenereerd in BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods’ interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
