Этот протокол детализирует метод производства трех различных типов сфероидов таким образом, чтобы сделать их пригодными для крупномасштабного скрининга и анализа с высоким содержанием. Кроме того, представлены примеры, показывающие, как их можно анализировать на сфероидном и индивидуальном клеточном уровнях.
Скрининг с высоким содержанием (HCS) и анализ высокого содержания (HCA) – это технологии, которые предоставляют исследователям возможность извлекать крупномасштабные количественные фенотипические измерения из клеток. Этот подход оказался мощным для углубления нашего понимания широкого спектра как фундаментальных, так и прикладных событий в клеточной биологии. На сегодняшний день большинство приложений для этой технологии полагаются на использование клеток, выращенных в монослоях, хотя все чаще осознается, что такие модели не повторяют многие взаимодействия и процессы, которые происходят в тканях. Таким образом, произошло появление в разработке и использовании 3-мерных (3D) клеточных сборок, таких как сфероиды и органоиды. Хотя эти 3D-модели особенно эффективны в контексте биологии рака и исследований доставки лекарств, их производство и анализ воспроизводимым способом, подходящим для HCS и HCA, представляют собой ряд проблем. Протокол, подробно описанный здесь, описывает метод генерации многоклеточных сфероидов опухоли (MCTS) и демонстрирует, что он может быть применен к трем различным клеточным линиям способом, совместимым с HCS и HCA. Метод облегчает добычу нескольких сотен сфероидов на скважину, обеспечивая конкретное преимущество в том, что при использовании в режиме скрининга данные могут быть получены из нескольких сотен структур на скважину, все обработаны одинаковым образом. Также приведены примеры, в которых подробно описывается, как обрабатывать сфероиды для флуоресцентной визуализации с высоким разрешением и как HCA может извлекать количественные признаки как на уровне сфероида, так и из отдельных клеток внутри каждого сфероида. Этот протокол может быть легко применен для ответа на широкий круг важных вопросов в клеточной биологии.
Традиционно клеточные анализы проводились в монослоях, растущих на твердой подложке, которую фактически можно рассматривать как двумерную (2D) среду. Тем не менее, все чаще признается, что 2D-модели клеточных культур не имеют физиологической значимости в некоторых контекстах и не могут воспроизвести многие сложные взаимодействия, которые происходят между клетками1. Трехмерные (3D) методы культивирования клеток быстро становятся популярными среди исследователей, а 3D-модели клеток показывают высокий потенциал для лучшего подражания физиологическим условиям, с которыми сталкиваются клетки в тканевой среде2. Существует несколько различных типов 3D-клеточных сборок, которые были использованы, но двумя наиболее распространенными типами являются сфероиды и органоиды. Сфероиды могут быть выращены из множества различных клеточных линий, и они могут принимать различные формы и размеры в зависимости от используемого типа клеток и их метода сборки3. Кроме того, сфероиды также могут называться многоклеточными сфероидами опухолей (MCTS), когда они выращиваются из линий раковых клеток, и эти модели нашли особое применение для доклинической доставки лекарств in vitro и исследований токсичности4,5. Органоиды, с другой стороны, стремятся лучше имитировать ткани и органы в нашем теле и могут принимать более сложные морфологические структуры. Производство органоидов включает в себя использование взрослых стволовых клеток или плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть перепрограммированы в соответствующие клетки, чтобы напоминать ткань или орган, представляющий интерес. Они в основном используются для исследования развития органов и моделирования заболеваний и взаимодействий хозяина и патогена6.
Существует ряд различных методов, используемых для создания 3D-сборок ячеек. Методы на основе каркаса обеспечивают субстрат или опору, к которой клетки могут либо прикрепляться, либо расти внутри. Эти леса могут иметь различные формы и могут быть изготовлены из множества различных материалов. Наиболее распространенными являются компоненты внеклеточного матрикса (ECM) и гидрогели, и они предназначены для того, чтобы напоминать естественную внеклеточную среду клеток и тем самым облегчать физиологические взаимодействия4,7. Материал фундамента ECM был извлечен из опухоли саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm и, как было показано, содержит богатую смесь компонентов ECM, включая ламинин, коллаген IV типа и перлекан8. Однако, несмотря на его выгодный состав, есть две основные проблемы с его использованием, а именно его изменчивость от партии к партии и то, что он имеет два различных агрегатных состояния ниже и выше 10 ° C8,9. Напротив, гидрогели имеют преимущество в том, что они гибкие по отношению к их компонентам и жесткости, и они могут быть настроены в соответствии с конкретной желаемой сборкой 3D-ячеек7,10. Методы на основе каркаса необходимы для роста органоидов, но также широко используются для сфероидов. Методы без каркаса, которые работают, предотвращая прикрепление клеток к поверхности, на которой они растут, обычно совместимы только со сфероидной сборкой. Примеры включают пластины со сверхнизким прикреплением (ULA) с плоским дном или U-образным дном, которые позволяют агрегировать ячейки в сфероиды, или использование непрерывного перемешивания ячеек в колбах спиннера/вращения10.
Использование 3D клеточных сборок для изучения широкого спектра биологических событий стремительно набирает популярность; однако важно, чтобы метод, выбранный для их культуры, был подходящим и совместимым с планами их последующего анализа. Например, использование пластин ULA генерирует сфероиды высокой консистенции; однако этот метод ограничен добычей одного сфероида на скважину, тем самым ограничивая пропускную способность. Особое внимание необходимо учитывать при планировании флуоресцентной визуализации 3D-структуры. Подложка или пластина, на которой выращивается сборка, должна быть оптически совместимой, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму последствия рассеяния света, вызванного любыми каркасами, которые могли быть использованы11. Эта конкретная проблема становится все более острой по мере увеличения числовой диафрагмы объективов микроскопа.
Возможно, одной из основных причин выбора работы с 3D-моделью клеток является извлечение объемных данных визуализации не только обо всей сборке, но и об отдельных клетках в ней. Модели MCTS, в частности, начинают оказываться очень мощными для углубления нашего понимания того, как терапевтические средства передаются извне в центральные клетки (как это необходимо в опухоли)12, и поэтому получение знаний от отдельных клеток в разных слоях имеет важное значение. Технология визуализации, которая извлекает количественную информацию из отдельных клеток, называется анализом высокого содержания (HCA) и является мощным подходом в контексте скрининга13. На сегодняшний день HCA почти исключительно применяется к однослойным культурам, но растет понимание того, что этот подход может быть применен к 3D-культурам, позволяющим изучать широкий спектр клеточных функций и процессов14. Это будет иметь явное преимущество в том, что большое количество 3D-сборок может быть проанализировано, потенциально предоставляя данные на уровне ячеек из каждой структуры. Однако необходимо преодолеть проблемы, связанные с визуализацией потенциально толстых клеточных сборок, а также больших наборов данных.
В данной статье представлен надежный каркасный метод крупномасштабной добычи MCTS в формате 96 скважин. Метод облегчает производство нескольких сотен 3D-клеточных сборок в каждой скважине. Примеры показаны для трех различных типов клеток, представляющих солидные опухолевые модели печени, легких и толстой кишки. Сфероиды, которые образуются, могут быть различных размеров, и поэтому HCA используется для выбора структур определенного размера и / или морфологии. Эта особенность обеспечивает дополнительное преимущество, что любые наблюдаемые фенотипы могут быть сопоставлены между сфероидами разных размеров, но все они обрабатываются одинаково в одной и той же колодце. Этот подход совместим с визуализацией с высоким разрешением, что важно, обеспечивая количественные данные как на клеточном, так и на субклеточном уровне из одних и тех же клеточных сборок. Этот метод производства сфероидов имеет дополнительное преимущество перед методами, которые генерируют один сфероид на скважину, что большое количество сфероидов, полученных в каждой скважине, потенциально обеспечивает достаточную биомассу для других последующих анализов, таких как транскриптом и протеомное профилирование.
Описанный здесь подход детализирует платформу для генерации нескольких сотен сфероидов на скважину способом, подходящим для HCS и HCA. По сравнению с другими популярными методами, такими как использование плоскодонных и круглодонных пластин ULA, которые позволяют образовывать только оди?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают поддержку гранта на инфраструктурные исследования от Научного фонда Ирландии (SFI) (16/RI/3745) JCS. Работа в лаборатории скрининга клеток UCD поддерживается Научным колледжем UCD. ASC финансируется Стипендией для аспирантов правительства Ирландии Ирландского исследовательского совета (IRC) (GOIPG/2019/68). Авторы также благодарят всех членов лаборатории за их вклад и полезные обсуждения. Иллюстрация на рисунке 1 была сгенерирована в BioRender.
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |