Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.
Abstract
A poluição ambiental é um problema crescente, e identificar fungos envolvidos no processo de bioremediação é uma tarefa essencial. O solo abriga uma incrível diversidade de vida microbiana e pode ser uma boa fonte desses fungos bioremediativos. Este trabalho tem como objetivo buscar fungos do solo com potencial de bioremediação utilizando diferentes testes de triagem. A mídia de cultura mineral complementada com substâncias recalcitrantes como única fonte de carbono foi usada como teste de crescimento. Primeiro, as diluições do solo foram banhadas em placas de Petri com meio mineral alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose. As colônias fúngicas em crescimento foram isoladas e testadas em diferentes substratos, como misturas complexas de hidrocarbonetos (petrolatum e óleo de motor usado) e pós de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Testes enzimáticos qualitativos estiveram associados aos testes de crescimento para investigar a produção de esterases, laccases, peroxidases e proteases. Essas enzimas estão envolvidas nos principais processos de degradação do material recalcitrante, e sua secreção constitutiva pelas cepas fúngicas examinadas poderia ter o potencial de ser explorada para a bioremediação. Mais de 100 cepas foram isoladas e testadas, e vários isolados com bom potencial de bioremediação foram encontrados. Em conclusão, os testes de triagem descritos são um método fácil e de baixo custo para identificar cepas fúngicas com potencial de bioremediação do solo. Além disso, é possível adequar os testes de triagem para diferentes poluentes, de acordo com as exigências, adicionando outras substâncias recalcitrantes aos meios de cultura mínimos.
Introduction
O solo é um componente fundamental da vida na Terra e é a base de muitos ecossistemas. Os minerais, matéria orgânica e microrganismos no solo podem ser considerados como um sistema, com associações próximas e interações ocorrendo entre eles. As interações desses compostos têm um impacto importante nos processos terrestres, na qualidade ambiental e na saúde do ecossistema1. A poluição do solo apresenta sérios problemas ambientais em todo o mundo. A aplicação indiscriminada, a longo prazo e excessiva de substâncias recalcitrantes e tóxicas, como pesticidas, produtos petrolíferos, plásticos e outros produtos químicos, tem efeitos sérios na ecologia do solo e, como resultado, pode alterar a microbiota do solo. As comunidades microbianas nos solos são compostas por uma ampla gama de organismos em diferentes estados fisiológicos, sendo a maioria bactérias e fungos. Muitos dos contaminantes nos solos têm estabilidade de médio a longo prazo, e sua persistência pode levar ao desenvolvimento de mecanismos adaptativos que permitem aos microrganismos utilizar substâncias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Esses microrganismos podem, portanto, ser considerados para técnicas de bioremediação.
A bioremediação tenta mitigar os efeitos da poluição usando microrganismos e suas enzimas para a degradação ou transformação de resíduos em compostos menos tóxicos ou não tóxicos. Várias espécies de arqueias, bactérias, algas e fungos possuem essa capacidade de bioremediação4. Como resultado de suas ações biodegradativas particulares, os fungos são especialmente organismos promissores para a bioremediação. Eles podem atacar diferentes substratos usando sua rede hignótica, permitindo-lhes penetrar a matriz do solo de forma mais eficiente do que outros microrganismos. Além disso, eles podem alcançar interstícios inacessíveis onde contaminantes são difíceis de remover5, e também podem sobreviver a baixos níveis de umidade6. Além disso, os fungos sintetizam diferentes fitas de enzimas inespecíficas, geralmente para degradar substâncias recalcitrantes naturais como celulose, lignina e ácidos húricos. Aqueles que não possuem o substrato alvo podem estar envolvidos na degradação de uma ampla gama de poluentes recalcitrantes, como hidrocarbonetos, plásticos e pesticidas 7,8,9,10. Portanto, embora muitas espécies fúngicas já tenham sido relatadas como agentes de bioremediação, há um interesse crescente em explorar espécies que ainda não foram estudadas para selecionar candidatos para a bioremediação de substâncias contaminantes recalcitrantes. As espécies já conhecidas por terem propriedades de bioremediação pertencem ao filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 e Mucoromycota. Por exemplo, os gêneros Penicillium e Aspergillus são bem conhecidos por estarem envolvidos na degradação dos hidrocarbonetos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metais pesados19 e corantes20. Da mesma forma, estudos realizados em fungos basidiomycetes, como Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor, revelaram seu envolvimento na oxidação de materiais recalcitrantes como hidrocarbonetos aromáticos13 e plásticos21. Outro exemplo de fungos envolvidos nos processos de biodegradação são os zigomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., e Cunninghamella spp.22,23. Em particular, Cunninghamella é capaz de oxidase hidrocarbonetos aromáticos e é considerado um organismo modelo para estudar a desintoxicação de produtos de uma ampla gama de xenobióticos13.
Existem várias enzimas fúngicas envolvidas nos principais processos degradativos de materiais recalcitrantes24,25, como esterase, laccase, peroxidase e protease. Laccases são oxidações contendo cobre produzidas na célula e posteriormente secretadas, que permitem a oxidação de uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos. Eles podem degradar ortos e para difenóis, os fenóis que contêm grupo amino, lignina e as diaminas contendo o grupo aryl26. Peroxidases usam peróxido de hidrogênio como mediador para degradar a lignina e outros compostos aromáticos. Existem muitas peroxidases diferentes, mas as que têm maior potencial para degradar substâncias tóxicas são a lignina peroxidase e a peroxidase de manganês27.
Esterases e proteases pertencem ao grupo de enzimas extra ou ecto-celular, que agem fora de suas células de origem, mas ainda estão ligadas a elas. Essas enzimas podem catalisar a hidrólise de grandes moléculas recalcitrantes em moléculas menores. Devido à sua baixa especificidade de substrato, essas enzimas podem desempenhar um papel fundamental na bioremediação de diversos poluentes, como corantes têxteis, efluentes liberados das indústrias de celulose e papel e bronzeamento de couro, produtos petrolíferos, plásticos e pesticidas 28,29,30.
Uma série de métodos de triagem para selecionar para cepas fúngicas bioremediativas já foram publicados. Por exemplo, o meio ágar à base de palha tem sido usado para triagem para fungos de podridão branca com alto potencial na degradação aromática policíclica (PAH)31; e pequenos pedaços de madeira podre foram colocados no ágar extrato de malte (MEA) para isolar fungos apodrecidos de madeira32. No entanto, a maioria dos métodos já propostos seleciona fungos muito específicos para sua atividade de interesse. Esta pesquisa propõe uma abordagem mais ampla para a seleção de fungos do solo com uma gama mais ampla de ação. O método baseia-se no revestimento inicial de diluições seriais de amostras de solo em um meio alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose misturado com antibióticos para selecionar fungos com a capacidade de degradar essas substâncias recalcitrantes naturais. Os ácidos húricos e a lignocelulose, na verdade, são substâncias extremamente resistentes à biodegradação, pois possuem estruturas moleculares muito complexas, o que permite que sejam excelentes indicadores da capacidade degradante dos fungos testados33,34. Posteriormente, os fungos selecionados nos primeiros testes são examinados para identificar aqueles com potencial para degradar poluentes específicos, como petrolatum, óleo de motor usado e plásticos. Finalmente, são realizados testes enzimáticos qualitativos para detectar cepas fúngicas capazes de produzir enzimas envolvidas nos processos de biodegradação de substâncias recalcitrantes. Para isso, são realizados testes de protease e esterase, enquanto o ácido gálico e o guaiacol são utilizados como indicadores de laccase e outras produções ligninolíticas35,36. Esses substratos são usados porque uma forte correlação foi encontrada entre a capacidade dos fungos de oxidar-os à sua forma de cor marrom e a posse da capacidade ligninolítica 37,38,39.
Através desses protocolos, é possível isolar cepas fúngicas com alto potencial degradante e um amplo espectro de ação diretamente das amostras do solo. O isolamento dessas cepas fúngicas poderia ajudar a encontrar novos candidatos para fins de bioremediação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A rica biodiversidade do solo é uma fonte abundante de fungos que possuem inúmeras habilidades metabólicas, algumas das quais podem ser potenciais candidatas à bioremediação. Testes de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) são métodos fáceis de executar e eficazes para isolar fungos capazes de crescer em polímeros complexos naturais como sua única fonte de carbono. Fungos podem produzir hidrolases extracelulares, não específicas e oxidoreductases30 , como as enzimas ligninolíticas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) da Universidade de Pavia e o Professor Solveig Tosi por proporcionarem a oportunidade para este trabalho.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
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