Inokulasjonsstrategier for å infisere planterøtter med jordbårne mikroorganismer
Summary
Denne protokollen presenterer en detaljert oppsummering av strategier for å inokulere planterøtter med jordbårne mikrober. Eksemplifisert for sopp Verticillium longisporum og Verticillium dahliae, er tre forskjellige rotinfeksjonssystemer beskrevet. Potensielle anvendelser og mulige nedstrømsanalyser fremheves, og fordeler eller ulemper diskuteres for hvert system.
Abstract
Rhizosfæren har et svært komplekst mikrobielt samfunn der planterøtter stadig utfordres. Røttene er i nær kontakt med et bredt spekter av mikroorganismer, men studier på jordbårne interaksjoner ligger fortsatt bak de som utføres på overjordiske organer. Selv om noen inokulasjonsstrategier for å infisere modellplanter med modellrotpatogener er beskrevet i litteraturen, er det fortsatt vanskelig å få en omfattende metodisk oversikt. For å løse dette problemet beskrives tre forskjellige rotinokulasjonssystemer nettopp som kan brukes for å få innsikt i biologien til rotmikrobeinteraksjoner. For illustrasjon ble Verticillium arter (nemlig V. longisporum og V. dahliae) ansatt som rotinvaderende modellpatogener. Metodene kan imidlertid enkelt tilpasses andre rotkoloniserende mikrober – både patogene og fordelaktige. Ved å kolonisere planten xylem, viser vaskulære jordbårne sopp som Verticillium spp. en unik livsstil. Etter rotinvasjon sprer de seg via xylem-fartøyene akropetalt, når skytingen og fremkaller sykdomssymptomer. Tre representative plantearter ble valgt som modellverter: Arabidopsis thaliana, økonomisk viktig oljefrø voldtekt (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum). Trinnvise protokoller er gitt. Representative resultater av patogenisitetsanalyser, transkripsjonsanalyser av markørgener og uavhengige bekreftelser fra reporterkonstruksjoner vises. Videre diskuteres fordelene og ulempene ved hvert inokulasjonssystem grundig. Disse velprøvde protokollene kan bidra til å gi tilnærminger til forskningsspørsmål om rotmikrobeinteraksjoner. Å vite hvordan planter takler mikrober i jorda er avgjørende for å utvikle nye strategier for å forbedre landbruket.
Introduction
Naturlige jordarter er bebodd av et forbløffende antall mikrober som kan være nøytrale, skadelige eller gunstige for planter1. Mange plantepatogener er jordbårne, omgir røttene og angriper det underjordiske organet. Disse mikroorganismer tilhører et bredt utvalg av clades: sopp, oomycetes, bakterier, nematoder, insekter og noen virus 1,2. Når miljøforholdene favoriserer infeksjon, vil mottakelige planter bli syke og avlingene avtar. Effektene av klimaendringer, som global oppvarming og ekstremvær, vil øke andelen jordbårne plantepatogener3. Derfor vil det bli stadig viktigere å studere disse destruktive mikrober og deres innvirkning på mat og fôrproduksjon, men også på naturlige økosystemer. I tillegg er det mikrobielle gjensidige i jorda som tett samhandler med røtter og fremmer plantevekst, utvikling og immunitet. Når de konfronteres med patogener, kan planter aktivt rekruttere spesifikke motstandere i rhizosfæren som kan støtte vertsoverlevelse ved å undertrykke patogener 4,5,6,7. Imidlertid er mekanistiske detaljer og veier involvert i gunstige rotmikrobeinteraksjoner ofte fortsatt ukjente6.
Det er derfor viktig å utvide den generelle forståelsen av rotmikrobeinteraksjoner. Pålitelige metoder for å inokulere røtter med jordbårne mikroorganismer er nødvendige for å utføre modellstudier og overføre funnene til landbruksapplikasjoner. Gunstige interaksjoner i jorda studeres for eksempel med Serendipita indica (tidligere kjent som Piriformospora indica), nitrogenfiksing Rhizobium spp., eller mycorrhizal sopp, mens kjente jordbårne plantepatogener inkluderer Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., og Verticillium spp.1. De to sistnevnte er soppgena som er globalt distribuert og forårsaker vaskulære sykdommer2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan infisere hundrevis av plantearter – i stor grad dikotyledoner, inkludert urteaktige årlige, treaktige stauder og mange avlingsplanter 2,8. Hyphae av Verticillium kommer inn i roten og vokser både intercellulært og intracellulært mot den sentrale sylinderen for å kolonisere xylemfartøyene 2,9. I disse karene forblir soppen for det meste av livssyklusen. Siden xylem sap er næringsfattig og bærer planteforsvarsforbindelser, må soppen tilpasse seg dette unike miljøet. Dette oppnås ved sekresjon av koloniseringsrelaterte proteiner som gjør at patogenet kan overleve i verten10,11. Etter å ha nådd rotvaskulaturen, kan soppen spre seg i xylemkarene akropetalt til løvet, noe som fører til systemisk kolonisering av verten 9,12. På dette tidspunktet påvirkes anlegget negativt i vekst 9,10,13. For eksempel oppstår stunting og gule blader, samt for tidlig senescence 13,14,15,16.
Et medlem av dette slaget er Verticillium longisporum, som er svært tilpasset messing verter, som den agronomisk viktige oljefrø voldtekt, blomkål, og modellplanten Arabidopsis thaliana12. Flere studier kombinerte V. longisporum og A. thaliana for å få omfattende innsikt i jordbårne vaskulære sykdommer og de resulterende rotforsvarsresponsene 13,15,16,17. Enkel følsomhetstesting kan realiseres ved hjelp av V. longisporum / A. thaliana modellsystem og veletablerte genetiske ressurser er tilgjengelige for begge organismer. Nært relatert til V. longisporum er patogenet Verticillium dahliae. Selv om både sopparter utfører en lignende vaskulær livsstil og invasjonsprosess, er deres forplantningseffektivitet fra røtter til blader og de fremkalte sykdomssymptomene i A. thaliana forskjellige: mens V. longisporum vanligvis induserer tidlig senescence, resulterer V. dahliae infeksjon i vanning18. Nylig presenterte et metodisk sammendrag forskjellige rotinokulasjonsstrategier for å infisere A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, som bistår i planlegging av eksperimentelle oppsett19. I felten forårsaker V. longisporum av og til betydelig skade i oljefrø voldtektsproduksjon12, mens V. dahliae har et svært bredt vertsområde som består av flere dyrkede arter, for eksempel vinranker, potet og tomat8. Dette gjør begge patogener økonomisk interessante modeller å studere.
Dermed bruker følgende protokoller både V. longisporum og V. dahliae som modellrotpatogener for å eksemplifisere mulige tilnærminger for rotinokulasjoner. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), oljefrø voldtekt (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum) ble valgt som modell verter. Detaljerte beskrivelser av metodene finner du i teksten nedenfor og den tilhørende videoen. Fordeler og ulemper for hvert inokulasjonssystem diskuteres. Samlet kan denne protokollsamlingen bidra til å identifisere en passende metode for spesifikke forskningsspørsmål i sammenheng med rotmikrobeinteraksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grunn av de enorme utbyttetapene forårsaket av jordbårne fytopatogene1, er det nødvendig med en forbedring av oppdrettsstrategier eller avlingsvarianter. Den begrensede innsikten i patogenesen av jordbårne sykdommer hindrer utviklingen av mer resistente planter. Underliggende patomekanismer må utforskes, som det kreves en robust metodisk plattform for. Rapporterte inokulasjonsprosedyrer har vist at multifaktorielle hendelser i rotmikrobeinteraksjoner kan dissekeres godt ved å kombinere f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner Tim Iven og Jaqueline Komorek for tidligere arbeid med disse metodene, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institutt for farmasøytisk biologi, Universitetet i Würzburg, Tyskland) for å levere utstyret og ressursene som trengs for dette arbeidet, og Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (begge Universitetet i Würzburg) for kritisk korrekturlesing av manuskriptet. Denne studien ble støttet av “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
