En metode til intraduktal injektion af reagenser til en ethanolbaseret ablativ opløsning til musebrystkanaltræet til in vivo-billeddannelse og forebyggelse af brystkræft er beskrevet. Injektion direkte i brystvorteåbningen gør det muligt at målrette brystepitelceller med minimal sikkerhedsvævsskade.
Brystkræft er den mest udbredte kræft og den næststørste årsag til kræftrelateret død for kvinder i USA. For højrisikokvinder er profylaktisk mastektomi den mest effektive primære forebyggelsesstrategi. Profylaktisk mastektomi er en aggressiv kirurgisk procedure, der fuldstændigt fjerner brystepitelcellerne, hvorfra brystkræft opstår sammen med det omgivende væv. Vi søger at udvikle en minimalt invasiv intraduktal procedure som et alternativ til profylaktisk mastektomi for lokalt at ablate brystepitelcellerne, før de kan blive ondartede. Vi og andre har udviklet en intraduktal leveringsprocedure for at nå og behandle disse epitelceller i gnavermodeller af brystkræft. Mens musebrystkirtlen med en enkelt ikke-anastomoseret duktal træåbning ved brystvorten har en meget mindre kompleks og snoet arkitektur end det menneskelige bryst, er kemisk inducerede og genetisk manipulerede musemodeller af brystkræft værdifulde til at producere proof-of-concept-undersøgelser af nye forebyggende strategier. Her beskriver vi en procedure for intraduktal levering af en ethanolbaseret ablativ opløsning indeholdende mikro-CT/røntgentantalbaseret kontrastmiddel i musebrystkanalens træ med det terapeutiske formål primær forebyggelse af brystkræft. Intraduktal levering af vandige reagenser (f.eks. cytotoksiske forbindelser, siRNA’er, AdCre) er tidligere beskrevet i musemodeller. Således fokuserer vi vores protokolbeskrivelse på metodologiske modifikationer og unikke eksperimentelle overvejelser for optimering af levering af ethanol, for at minimere lokale og systemiske bivirkninger af ethanoladministration og for in vivo-visualisering af duktal træfyldning via mikro-CT / fluoroskopi billeddannelse. Visualisering af duktaltræet umiddelbart efter injektion af en kontrastholdig opløsning muliggør bekræftelse af fuldstændig påfyldning eller mislykkede resultater såsom underfyldning eller overfyldning. Denne procedure kan anvendes til levering og billeddannelse af andre ablative forbindelser med det formål enten at forhindre tumordannelse eller lokalt behandle tidlige stadier af tumorer, der er tilgængelige via duktaltræet.
Brystkræft er en almindelig og potentielt dødelig sygdom med få muligheder for forebyggelse1. Den mest effektive intervention er profylaktisk mastektomi; Det er dog kun personer med høj risiko, der vælger at gennemgå denne procedure, da det er en operation med store livsændrende konsekvenser2. Proceduren fjerner fuldstændigt brystepitelcellerne, hvorfra brystkræft opstår sammen med det omgivende væv. Dette kan resultere i fysisk, psykologisk og social stress for den enkelte og afskrækker ofte enkeltpersoner fra at fortsætte med denne kirurgiske procedure som deres første linje af primær intervention.
Vi har påvist, at levering af en ablativ opløsning indeholdende 70 % ethanol (EtOH) direkte ind i duktaltræet er effektiv til at dræbe brystepitelceller med begrænset sikkerhedsvævsskade og til at forebygge brysttumorer i musemodeller3. EtOH har længe været anvendt klinisk som et ablativt eller skleroserende middel til lokal behandling. Perkutan EtOH-injektion anvendes som et ablativt middel til ikke-resekterbare levertumorer, nyre- og binyresyreneoplasmer og cystiske tumorer i bugspytkirtlen4,5,6; til cøliaki plexus neurolyse for at reducere smerte7; og til behandling af brystpseudoneurismer8. Intravaskulær EtOH-injektion anvendes som et skleroserende middel til at eliminere hævelse og deformation fra arteriovenøse misdannelser (AVM) og til kosmetisk behandling af edderkopper og åreknuder9,10,11,12,13. Ligesom profylaktisk mastektomi afhænger forebyggelsens succes med lokal levering af en ablativ opløsning af evnen til fuldstændigt at fjerne alle brystepitelceller, hvorfra kræft potentielt kan opstå. Dette kræver bekræftelse på, at det ablative stof med succes har fyldt duktaltræet og dermed kontaktet alle brystepitelceller direkte. Kliniske midler til injektion af stoffer i brystkirtlerne og visualisering af dem ved hjælp af billedstyret fluoroskopi eller kanalografi er let tilgængelige14,15; Det vil derfor være muligt både at levere og bekræfte en vellykket levering, når denne procedure kan berettige evaluering i kliniske forsøg.
At demonstrere gennemførligheden af denne billedstyrede tilgang hos forsøgsdyr er et vigtigt skridt i retning af at fastslå effektiviteten og den translationelle gennemførlighed af intraduktal (ID) ablation som en forebyggende foranstaltning mod brystkræft. I vores laboratorium har vi udviklet en metode til med succes at injicere alle brystkirtler i mus med en ablativ opløsning indeholdende et kontrastmiddel i løbet af ugentlige injektioner for at sikre, at dyret ikke bukker under for en overdosis etOH (figur 1, figur 2, reference nr. 3,16). Denne procedure placerer en 34 G-nål inde i brystvorteåbningen af en isofluran-anæstesiiseret mus for at injicere testopløsningen. Nogle vigtige forbedringer af proceduren omfatter brugen af gastætte sprøjter til væske og gasser, injektion af højere volumener pr. duktale træer17 og udvidet antiinflammatorisk behandling. Den prækliniske behandling af 5 mg/kg carprofen, et NSAID, fra 2 d før til 7 d efter ID-proceduren er i overensstemmelse med behandlingen af klinisk skleroserende behandling for AVM. Efter systemisk anæstesi modtager patienterne typisk antiinflammatoriske lægemidler, såsom NSAID’er, i 2 dage efter proceduren, der kan forlænges for at afbøde enhver lokal betændelse eller smerte12. Alkoholforgiftning mindskes signifikant ved intraperitoneal injektion af en 5% saccharoseopløsning i mus. Ved administration af denne saccharoseopløsning kan mus sikkert injiceres med op til 160 μL 70% EtOH (op til fire duktale træer; ca. 0,4 g / dl EtOH-indhold i blod); dyr, der er fuldt genoprettet inden for 4 timer efter ID-injektioner. Til injektion af mere end fire kirtler i mus og / eller højere EtOH-koncentrationer udfører vi sekventielle sessioner for at give tilstrækkelig restitutionstid. Alkoholforgiftning hos kvinder ville være en mindre bekymring på grund af den lavere andel af alkoholmængde til kropsvægt. I betragtning af antallet af kanaltræer i menneskebryst14,15, ca. 16 og anslået volumen til at fylde hver trækanal18,19, vil op til 32 ml 70% EtOH blive administreret. Denne mængde vil være meget lavere end de 50 ml etOH, der administreres i andre kliniske procedurer4,9. Intravenøs administration af thiamin og glucoseopløsning kan anvendes til yderligere at minimere virkningerne af EtOH-forgiftning, især i tilfælde, hvor det kan være nødvendigt at injicere et større samlet volumen EtOH og/eller for kvinder, der har en lavere tolerance over for alkoholforbrug (f.eks. allelvarianter i alkohol eller aldehyddehydrogenaser).
Billeddannelse via mikro-CT / fluoroskopi giver os mulighed for at bekræfte en vellykket kanalfyldning af hver kirtel (figur 1, figur 2, figur 3). Dette kan registreres med henblik på fremtidig analyse eller vurderes i øjeblikket via fluoroskopi i realtid, som det ville ske i klinisk anvendelse, for at begrænse den samlede strålingsbyrde, der pålægges dyret. For yderligere at forbedre specifikke egenskaber ved denne ablative løsning til billedstyret levering i realtid in vivo sammenlignede vi tidligere FDA-godkendt jodholdig kontrast med et tantaloxid (TaOx)-indeholdende nanopartikel syntetiseret af Shapiro-laboratoriet3,16. TaOx viste overlegen ydeevne som et mikro-CT-kontrastmiddel til visualisering af den indledende fyldning af duktaltræet (figur 2, figur 3). TaOx kan anvendes som referencekontrast til at udføre en mere systematisk og langsgående vurdering af andre nanopartikelbaserede blodpoolkontrastmidler (f.eks. jod-, vismut- eller guldholdige) og TaOx’s kompatibilitet med forskellige koncentrationer af ethylcellulose som geleringsmiddel20,21.
Profylaktisk mastektomi er i øjeblikket den mest effektive intervention for brystkræft, men det har nogle alvorlige negative virkninger. Lokal ablation af brystepitelceller med en EtOH-baseret opløsning er en lovende alternativ behandling, som vi demonstrerede i et proof-of-concept-studie om den aggressive FVB-Tg-C3(1)-TAg-musemodel for brystkræft3. ID-injektion af denne ablative opløsning muliggør målretning af brystepitelcellerne, hvorfra brystkræft opstår med begrænset sikkerhedsskade. Tilsætning af et røntgenkontrastmiddel til den ablative opløsning giver mulighed for øget forståelse af opløsningens effektivitet ved forebyggelse, da vi kan se, om hvert duktaltræ med succes er fyldt efter injektion (figur 2B). Visning af injicerede kirtler ved fluoroskopi straks efter injektion afspejler, hvad der sandsynligvis vil blive gjort i klinikken for at bekræfte en vellykket påfyldning af duktaltræet. Visuel bekræftelse af løsningslevering vil bedst informere om, hvorvidt alle dele af træet er nået i realtid. Dette kan gøre det muligt at udføre yderligere injektion for at fuldføre påfyldningen på det tidspunkt eller i en fremtidig session. Det er af stor betydning, at ablativ opløsning når alle dele af duktaltræet for at sikre, at alle epitelceller kan tilgås til aflivning (figur 3). Efterladelse af levende epitelceller i træet ville give mulighed for, at brystkræft stadig kunne opstå. Brug af kontrast i ID-injektioner til billedsucces af injektionen kan også være nyttig til andre formuleringer. Tabel 1 indeholder fejlfinding og nyttige tip. Andre undersøgelser har beskrevet ID-leveringsprotokoller for virale partikler (f.eks. AdCre, CRISPR-guide-RNA’er), hormoner, cytotoksiske forbindelser, siRNA’er og/ eller målretningsmidler i mus3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, rotter24,32,39,40,41 og kaniner42,43,44,45,46,47. Uafhængige kliniske undersøgelser rapporterede vellykket kanylering af op til otte kanaler pr. Bryst til lokal levering af kemoterapi40,48,49. Visualisering af fuld påfyldning, når du leverer andre løsninger, der sigter mod forebyggelse eller rettet mod behandling, ville være umagen værd af lignende grunde. Viden om, at løsningen har nået alle grene og terminale ender af træet, vil være informativ i vurderingen af vellykket forebyggelse eller behandling.
Vi er ikke bekendt med andre intraduktale billeddannelsesmetoder i mus33,34 eller andre dyremodeller47, der giver den høje opløsning af TaOx nanopartikler. Bemærk, at TaOx i murine duktaltræet overgår FDA-godkendte kontrastmidler til diagnostisk kanalografi3,16. Da vi fortsætter med at vurdere ID-ablativeproceduren for dens evne til at forhindre brystkræft, vil vi være i stand til at bestemme mere præcist, hvorfra kirtler kræft opstår ved hjælp af tilføjede data givet gennem billeddannelse efter ID-levering. For eksempel kunne man afgøre, om en kirtel, der kun var delvist fyldt, er mere tilbøjelig end en ikke-injiceret kirtel til at resultere i tumordannelse, hvilket adresserer sikkerhedsprofilen og bekymringen for mislykkede injektioner på en højrisikokvinde. Denne teknik har nogle begrænsninger. Dette er en relativt udfordrende museteknik, der kræver fingerfærdighed og dygtighed hos operatøren til at manipulere og med succes kanyle hver kanal. Hver enkelt injektion er en uafhængig begivenhed, så mislykket injektion på en eller flere kirtler kan kompromittere resultatfortolkningen. I betragtning af størrelsen af murine brystkirtlen og skrøbelighed i brystvorten er fluoroskopi eller lignende billedvejledningsteknik ikke tilgængelig for at informere i realtid, hvornår infusionen skal stoppes. Denne realtidsbilledvejledning vil være et krav til klinisk implementering af lokal levering af en ablativ løsning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute R21 CA226579 og R01 CA258314 tilskud til LFS og af National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 tilskud til EMS. Vi vil gerne takke MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core facilitet for brug af deres billeddannelsessystemer og tekniske ekspertise. Vi vil gerne takke Dr. Danielle Ferguson for at gennemgå indholdet af videoen og tallene for overholdelse af dyrevelfærdsretningslinjerne.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |