मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कृत्रिम फॉस्फोलिपिड माइक्रोवेसिकल्स के साथ फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण करना
Summary
यहां, हम कोशिकाओं या माइक्रोवेसिकल्स की झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत को चिह्नित करने के तरीकों के एक सेट का वर्णन करते हैं।
Abstract
मानव शरीर में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रक्त जमावट में शामिल अधिकांश प्रमुख शारीरिक प्रतिक्रियाएं कोशिकाओं की झिल्ली पर आगे बढ़ती हैं। किसी भी झिल्ली-निर्भर प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहला कदम फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर प्रोटीन का बंधन है। लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विकसित किया गया है। यह विधि जीवित कोशिकाओं और प्राकृतिक या कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं का उपयोग करके प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देती है। इस पद्धति का लाभ अभिकर्मकों और उपकरणों की सादगी और उपलब्धता है। इस विधि में, फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके प्रोटीन को लेबल किया जाता है। हालांकि, स्व-निर्मित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दोनों, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयुग्मन के बाद, प्रोटीन को फॉस्फोलिपिड झिल्ली (माइक्रोवेसिकल्स या कोशिकाओं) के स्रोत के साथ ऊष्मायन किया जाता है, और नमूनों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। प्राप्त डेटा का उपयोग गतिज स्थिरांक और संतुलन की गणना करने के लिए किया जा सकता है कघ। इसके अलावा, विशेष अंशांकन मोतियों का उपयोग करके फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की अनुमानित संख्या का अनुमान लगाना संभव है।
Introduction
बायोमेम्ब्रेन पशु कोशिकाओं और बाह्य अंतरिक्ष की आंतरिक सामग्री को अलग करते हैं। ध्यान दें कि झिल्ली कोशिका के जीवन चक्र और ऑर्गेनेल के दौरान गठित माइक्रोवेसिकल्स को भी घेरती है। कोशिका झिल्ली मुख्य रूप से लिपिड और प्रोटीन से बना होता है। झिल्ली प्रोटीन सिग्नलिंग, संरचनात्मक, परिवहन और चिपकने वाला कार्य करते हैं। हालांकि, बाह्य अंतरिक्ष के साथ पशु कोशिका के अंतर्संबंध के लिए लिपिड बाइलेयर भी आवश्यक है। यह पत्र लिपिड झिल्ली के साथ बाहरी प्रोटीन की परिधीय बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है।
एक पशु कोशिका की बाहरी झिल्ली परत पर होने वाली प्रतिक्रियाओं का सबसे हड़ताली उदाहरण रक्त जमावट प्रतिक्रिया है। रक्त जमावट की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि सभी मुख्य प्रतिक्रियाएं इन कोशिकाओं से उत्पन्न कोशिकाओं और माइक्रोवेसिकल्स के फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर आगे बढ़ती हैं, न कि प्लाज्मा 1,2,3 में। झिल्ली-निर्भर प्रतिक्रियाओं में जमावट शुरू करने की प्रक्रिया शामिल है (सबेंडोथेलियम की कोशिका झिल्ली पर, सूजन एंडोथेलियम, या सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर, ऊतक कारक की भागीदारी के साथ), कारकों के मुख्य कैस्केड-सक्रियण की सभी प्रतिक्रियाएं IX, एक्स, प्रोथ्रोम्बिन; थ्रोम्बिन द्वारा कारक ग्यारहवीं की सक्रियता (सक्रिय प्लेटलेट्स, एरिथ्रोसाइट्स, लिपोप्रोटीन और माइक्रोवेसिकल्स की झिल्ली पर); प्रोटीन सी मार्ग की प्रतिक्रियाएं; जमावट एंजाइमों की निष्क्रियता (थ्रोम्बोमोडुलिन कॉफ़ैक्टर्स, एंडोथेलियल प्रोटीन सी रिसेप्टर, हेपरान सल्फेट की भागीदारी के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली पर); और संपर्क मार्ग प्रतिक्रियाएं (प्लेटलेट्स की झिल्ली और अज्ञात कॉफ़ैक्टर्स की भागीदारी के साथ कुछ माइक्रोवेसिकल्स पर)। इस प्रकार, रक्त कोशिकाओं की झिल्ली के साथ विभिन्न प्लाज्मा प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन किए बिना रक्त जमावट की जांच करना असंभव है।
यह पत्र कोशिकाओं या माइक्रोवेसिकल्स के लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत की विशेषता के लिए एक प्रवाह-साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण शुरू में प्लेटलेट्स और कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ रक्त प्लाज्मा की बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तावित किया गया था। इसके अलावा, अध्ययन किए गए अधिकांश प्रोटीन नकारात्मक रूप से चार्ज झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स के साथ सीधे बातचीत करते हैं, विशेष रूप से फॉस्फेटिडिलसेरिन 4,5 के साथ। इसके अतिरिक्त, ऐसे प्रोटीन हैं जिनकी झिल्ली के साथ बातचीत विशेष रिसेप्टर्स6 द्वारा मध्यस्थता की जाती है।
प्रवाह साइटोमेट्री की एक महत्वपूर्ण क्षमता अतिरिक्त पृथक्करण के बिना मुक्त और बाध्य लिगेंड के बीच भेदभाव कर रही है। साइटोमेट्री की यह विशेषता समापन बिंदु पर लिगैंड संतुलन बाध्यकारी के अध्ययन की अनुमति देती है और निरंतर गतिज माप करने में मदद करती है। तकनीक अपरिष्कृत है और जटिल नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सक्रिय रूप से फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स, रिसेप्टर्स और जी-प्रोटीन के बीच बातचीत की गतिशीलता का मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए किया जाता है बरकरार और डिटर्जेंट-पारगम्य न्यूट्रोफिल7. यह दृष्टिकोण प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन और वास्तविक समय 8 में एंडोन्यूक्लाइज गतिविधि के कैनेटीक्स की खोज के लिए भी लागूहोता है। समय के साथ, इस पद्धति का उपयोग शुद्ध लिपिड पुटिकाओं9 के साथ उच्च आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए किया गया था, या, अधिक आम तौर पर, झिल्ली प्रोटीन के साथ एक अत्यधिक कुशल एसएफ 9 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली10 में व्यक्त किया गया था। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रोटीन-लिपोसोम इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए मात्रात्मक तरीकों का भी वर्णन किया गया है11.
यह तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोतियों का उपयोग करने से बचने के लिए स्व-निर्मित अंशांकन मोतियों का उपयोग करती है7. पहले7 इस्तेमाल किए गए अंशांकन मोती फ्लोरोसिन के साथ काम करने का इरादा रखते थे, जो प्रोटीन पर सुलभ फ्लोरोसेंट लिगेंड के वर्गीकरण को प्रतिबंधित करता था। इसके अलावा, यह पेपर उचित समय रिज़ॉल्यूशन के लिए गतिज डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने का एक नया तरीका प्रदान करता है। यद्यपि इस विधि को कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन एक अलग लिपिड संरचना के साथ कोशिकाओं, प्राकृतिक पुटिकाओं या कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए इसकी अनुकूलनक्षमता के लिए कोई स्पष्ट सीमाएं नहीं हैं। यहां वर्णित विधि बातचीत (केऑन, केऑफ) और संतुलन (केडी) के मापदंडों के अनुमान की अनुमति देती है और झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की संख्या के मात्रात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है। ध्यान दें कि यह तकनीक बाध्यकारी साइटों की संख्या का अनुमानित अनुमान प्रदान करती है। विधि के फायदे इसकी सापेक्ष सादगी, पहुंच और देशी कोशिकाओं और प्राकृतिक और कृत्रिम माइक्रोवेसिकल्स के लिए अनुकूलनक्षमता हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तावित विधि को विभिन्न स्रोतों और रचनाओं से फॉस्फोलिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत के किसी न किसी लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहां वर्णित मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री कई म…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को रूसी विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 20-74-00133 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
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