Анализ взаимодействия флуоресцентно-меченых белков с искусственными фосфолипидными микровезикулами с помощью количественной проточной цитометрии
Summary
Здесь описан набор методов характеристики взаимодействия белков с мембранами клеток или микровезикулами.
Abstract
В организме человека большинство основных физиологических реакций, участвующих в иммунном ответе и свертывании крови, протекают на мембранах клеток. Важным первым шагом в любой мембранозависимой реакции является связывание белка на фосфолипидной мембране. Разработан подход к изучению взаимодействия белков с липидными мембранами с использованием флуоресцентно меченых белков и проточной цитометрии. Этот метод позволяет изучать белково-мембранные взаимодействия с использованием живых клеток и природных или искусственных фосфолипидных везикул. Преимуществом данного метода является простота и доступность реагентов и оборудования. В этом методе белки маркируются с помощью флуоресцентных красителей. Тем не менее, могут использоваться как самодельные, так и коммерчески доступные, флуоресцентно меченые белки. После конъюгации с флуоресцентным красителем белки инкубируют с источником фосфолипидной мембраны (микровезикулами или клетками), а образцы анализируют методом проточной цитометрии. Полученные данные могут быть использованы для расчета кинетических констант и равновесия Kd. Кроме того, можно оценить приблизительное количество сайтов связывания белка на фосфолипидной мембране с помощью специальных калибровочных шариков.
Introduction
Биомембраны разделяют внутреннее содержимое клеток животных и внеклеточное пространство. Обратите внимание, что мембраны также окружают микровезикулы, образующиеся в течение жизненного цикла клетки, и органеллы. Клеточная мембрана преимущественно состоит из липидов и белков. Мембранные белки выполняют сигнальные, структурные, транспортные и адгезивные функции. Однако липидный бислой также необходим для взаимосвязи животной клетки с внеклеточным пространством. В данной работе предложен метод исследования периферического взаимодействия внешних белков с липидной мембраной.
Наиболее ярким примером реакций, происходящих на внешнем мембранном слое животной клетки, является реакция свертывания крови. Важной особенностью свертывания крови является то, что все основные реакции протекают на фосфолипидных мембранах клеток и микровезикул, возникающих из этих клеток, а не в плазме 1,2,3. К мембранозависимым реакциям относят процесс запуска коагуляции (на клеточных мембранах субэндотелия, воспаленный эндотелий или активированные иммунные клетки, при участии тканевого фактора), все реакции основного каскада – активация факторов IX, X, протромбина; активация фактора XI тромбином (на мембранах активированных тромбоцитов, эритроцитов, липопротеинов, микровезикул); реакции белкового пути С; инактивация ферментов свертывания (на мембранах эндотелиальных клеток с участием тромбомодулиновых кофакторов, рецептора эндотелиального белка С, гепарансульфата); и реакции контактного пути (на мембранах тромбоцитов и некоторых микровезикул с участием неизвестных кофакторов). Таким образом, невозможно исследовать свертываемость крови без изучения взаимодействия различных белков плазмы с мембраной клеток крови.
В данной работе описан метод на основе проточной цитометрии для характеристики взаимодействия белков с липидными мембранами клеток или микровезикул. Такой подход изначально предлагался для изучения взаимодействия плазмы крови с тромбоцитами и искусственными фосфолипидными везикулами. Более того, большинство исследуемых белков взаимодействуют непосредственно с отрицательно заряженными мембранными фосфолипидами, в частности с фосфатидилсерином 4,5. Дополнительно существуют белки, взаимодействие которых с мембраной опосредовано специальными рецепторами6.
Важной способностью проточной цитометрии является различение свободных и связанных лигандов без дополнительного разделения. Эта особенность цитометрии позволяет изучать равновесное связывание лигандов в конечной точке и помогает выполнять непрерывные кинетические измерения. Методика бессложна и не требует сложной пробоподготовки. Проточная цитометрия активно используется для количественного изучения динамики взаимодействия флуоресцентных пептидов, рецепторов и G-белков в интактных и детергентно-проницаемых нейтрофилах7. Этот подход также применим для изучения белково-ДНК-взаимодействий и кинетики активности эндонуклеазы в режиме реального времени8. Со временем этот метод был использован для количественного изучения высокоаффинных белково-белковых взаимодействий с очищенными липидными везикулами9 или, в более общем плане, с мембранными белками, экспрессируемыми в высокоэффективной системе экспрессии клеток Sf910. Также описаны количественные методы характеристики белково-липосомных взаимодействий с использованием проточной цитометрии трансмембранных белков11.
В этом методе используются самодельные калибровочные бусины, чтобы избежать использования коммерчески доступных бусин7. Калибровочные шарики, используемые ранее7 , предназначались для работы с флуоресцеином, который существенно ограничивал ассортимент доступных флуоресцентных лигандов на белках. Кроме того, в этой статье предлагается новый способ получения и анализа кинетических данных для разумного разрешения времени. Хотя этот способ описан для искусственных фосфолипидных везикул, нет очевидных ограничений его приспособляемости к клеткам, природным везикулам или искусственным фосфолипидным везикулам с другим липидным составом. Способ, описанный в настоящем описании, позволяет оценить параметры взаимодействия (kon, koff) и равновесия (Kd) и облегчает количественную характеристику числа сайтов связывания белка на мембране. Обратите внимание, что этот метод дает приблизительную оценку количества сайтов связывания. Преимуществами метода являются его относительная простота, доступность и приспособляемость к нативным клеткам и природным и искусственным микровезикулам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предложенный способ может быть адаптирован для грубой характеристики взаимодействия белков с фосфолипидными мембранами из различных источников и композиций. Описанная здесь количественная проточная цитометрия уступает поверхностному плазмонному резонансу (SPR) по нескольким параме…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторов поддержал грант Российского научного фонда 20-74-00133.
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochimie. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochimie. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochimie. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF – Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
