एक साथ ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन और इलेक्ट्रिकल न्यूरल रिकॉर्डिंग के लिए ऑप्ट्रोड ऐरे
Summary
यहां, हम प्रकाश वितरण के लिए ऑप्टिकल फाइबर और तंत्रिका रिकॉर्डिंग के लिए एक इलेक्ट्रोड सरणी के साथ एक ऑप्ट्रोड सिस्टम की निर्माण विधि प्रस्तुत करते हैं। चैनलरोडोप्सिन -2 व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों के साथ विवो प्रयोगों में एक साथ ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए सिस्टम की व्यवहार्यता दिखाई देती है।
Abstract
पिछले दशक के दौरान, ऑप्टोजेनेटिक्स चयनात्मक तंत्रिका मॉडुलन या निगरानी की अपनी अनूठी क्षमता के कारण तंत्रिका सिग्नलिंग की जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गया है। चूंकि विशिष्ट प्रकार की न्यूरोनल कोशिकाओं को ऑप्सिन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है, ऑप्टोजेनेटिक्स चयनित न्यूरॉन्स के ऑप्टिकल उत्तेजना या निषेध को सक्षम बनाता है। ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए ऑप्टिकल सिस्टम में कई तकनीकी प्रगति हुई है। हाल ही में, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना या निषेध के लिए तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ प्रकाश वितरण के लिए ऑप्टिकल वेवगाइड को संयोजित करने का प्रस्ताव किया गया था। इस अध्ययन में, एम्बेडेड मल्टीचैनल इलेक्ट्रोड के साथ एक प्रत्यारोपण योग्य ऑप्ट्रोड सरणी (2×2 ऑप्टिकल फाइबर) विकसित किया गया था।
एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) को प्रकाश स्रोत के रूप में नियोजित किया गया था, और ऑप्टिकल फाइबर की नोक पर पर्याप्त प्रकाश शक्ति प्रदान करने के लिए एक माइक्रोफैब्रिकेटेड माइक्रोलेंस सरणी को एकीकृत किया गया था। ऑप्ट्रोड सरणी प्रणाली में डिस्पोजेबल भाग और पुन: प्रयोज्य भाग शामिल हैं। डिस्पोजेबल भाग में ऑप्टिकल फाइबर और इलेक्ट्रोड होते हैं, जबकि पुन: प्रयोज्य भाग में प्रकाश नियंत्रण और तंत्रिका सिग्नल प्रोसेसिंग के लिए एलईडी और इलेक्ट्रॉनिक सर्किटरी होती है। प्रत्यारोपण योग्य ऑप्ट्रोड सरणी प्रणाली का उपन्यास डिजाइन ऑप्ट्रोड प्रत्यारोपण सर्जरी, ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तंत्रिका रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया के अलावा वीडियो में पेश किया गया है। इन विवो प्रयोगों के परिणामों ने चूहों के हिप्पोकैम्पस उत्तेजक न्यूरॉन्स से प्रकाश उत्तेजनाओं द्वारा उत्पन्न समय-बंद तंत्रिका स्पाइक्स को सफलतापूर्वक दिखाया।
Introduction
तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करना और नियंत्रित करना यह समझने के लिए आवश्यक है कि मस्तिष्क तंत्रिका नेटवर्क में और सेलुलर स्तरों पर कैसे कार्य करता है। पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग विधियों में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पैच क्लैंप 1,2,3,4 और माइक्रोन्यूरल इलेक्ट्रोड 5,6,7,8 का उपयोग करके बाह्य रिकॉर्डिंग शामिल है। न्यूरोमॉड्यूलेशन विधि के रूप में, विद्युत उत्तेजना का उपयोग अक्सर न्यूरोनल कोशिकाओं के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष विध्रुवण के माध्यम से फोकल मस्तिष्क क्षेत्र को सीधे उत्तेजित करने के लिए किया जाता है। हालांकि, विद्युत विधि रिकॉर्डिंग या उत्तेजना के लिए न्यूरोनल सेल प्रकारों को अलग नहीं कर सकती है क्योंकि विद्युत धाराएं सभी दिशाओं में फैलती हैं।
एक उभरती हुई तकनीक के रूप में, ऑप्टोजेनेटिक्स ने यह समझने में एक नए युग की शुरुआत की है कि तंत्रिका तंत्र कैसे काम करता है 9,10,11,12,13,14,15,16. ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों का सार आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त प्रकाश-संवेदनशील ऑप्सिन प्रोटीन की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश का उपयोग करना है। इस प्रकार, ऑप्टोजेनेटिक्स जटिल तंत्रिका सर्किट14,17 में आनुवंशिक रूप से चयनित कोशिकाओं के परिष्कृत मॉडुलन या निगरानी को सक्षम बनाता है। ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के व्यापक उपयोग ने ऑप्टिकल न्यूरोमॉड्यूलेशन की सीधे पुष्टि करने के लिए एक साथ तंत्रिका रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रकाश नियंत्रण और रिकॉर्डिंग कार्यों के साथ एक एकीकृत उपकरणअत्यंत मूल्यवान होगा 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
पारंपरिक, लेजर-आधारित ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना की सीमाएं हैं, जिसके लिए भारी और महंगी प्रकाश वितरण प्रणाली 26,27,28,29,30 की आवश्यकता होती है। इसलिए, कुछ शोध समूहों ने प्रकाश वितरण प्रणाली 31,32,33,34 के आकार को कम करने के लिए μLED-आधारित सिलिकॉन जांच को नियोजित किया। हालांकि, एलईडी की कम ऊर्जा रूपांतरण दक्षता के कारण μLEDs के साथ सीधे संपर्क के कारण थर्मल मस्तिष्क क्षति का खतरा है। थर्मल क्षति30,35,36,37,38,39 से बचने के लिए ऑप्टिकल फाइबर, एसयू -8 और सिलिकॉन ऑक्सीनाइट्राइड (सियोन) जैसे हल्के वेवगाइड लागू किए गए हैं। हालांकि, प्रकाश स्रोतों और वेवगाइड के बीच इसकी कम युग्मन दक्षता के कारण इस रणनीति में एक खामी भी है।
माइक्रोलेंस सरणी को पहले एलईडी और ऑप्टिकल फाइबर40 के बीच प्रकाश युग्मन दक्षता बढ़ाने के लिए पेश किया गया था। माइक्रोस्केल40 पर ऑप्टिकल उत्तेजना और विद्युत रिकॉर्डिंग के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) प्रौद्योगिकियों के आधार पर एक ऑप्ट्रोड सिस्टम विकसित किया गया था। एक एलईडी और ऑप्टिकल फाइबर के बीच माइक्रोलेंस सरणी ने प्रकाश दक्षता में 3.13 डीबी की वृद्धि की। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, एक 2×2 ऑप्टिकल फाइबर सरणी 4×4 माइक्रोलेंस सरणी पर गठबंधन किया गया है, और एलईडी माइक्रोलेंस सरणी के नीचे तैनात है। मस्तिष्क क्षति को कम करने के लिए 4×4 के बजाय 2×2 ऑप्टिकल फाइबर लगाए जाते हैं। एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड सरणी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (चित्रा 1 बी) के लिए छेद के माध्यम से सिलिकॉन का उपयोग करके ऑप्ट्रोड सरणी से सटे स्थित है।
सिस्टम में एक शीर्ष डिस्पोजेबल भाग और वियोज्य निचले हिस्से होते हैं। शीर्ष डिस्पोजेबल भाग, जिसमें ऑप्टिकल फाइबर सरणी, माइक्रोलेंस सरणी और टंगस्टन इलेक्ट्रोड सरणी शामिल है, को विवो प्रयोगों के लिए मस्तिष्क में स्थायी रूप से प्रत्यारोपित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। निचले हिस्से में एक एलईडी प्रकाश स्रोत और एक बाहरी बिजली आपूर्ति लाइन शामिल है, जो किसी अन्य पशु प्रयोग के लिए आसानी से हटाने योग्य और पुन: प्रयोज्य है। एक संलग्न प्लास्टिक कवर डिस्पोजेबल भाग की रक्षा करता है जब वियोज्य भाग को हटा दिया जाता है।
सिस्टम की व्यवहार्यता को ट्रांसजेनिक चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपण द्वारा सत्यापित किया जाता है जो सीए 2 + / शांतोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज द्वितीय-पॉजिटिव न्यूरॉन्स (सीएएमकेआईआईआई:: सीएचआर2 माउस) में चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) व्यक्त करते हैं। न्यूरॉन्स के ऑप्टिकल उत्तेजना के दौरान व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से तंत्रिका गतिविधियों को रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक साथ ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए सिस्टम की व्यवहार्यता सत्यापित की गई थी (चित्रा 6)। प्रकाश उत्तेजना के दौरान बड़े स्पाइक्स प्रकाश उत्तेजना (<strong class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से मानव संवर्धन के लिए अभिसरण प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय (एनआरएफ -2019 एम 3 सी 1 बी 80 9 0805) द्वारा वित्त पोषित था, और कोरिया सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित था (संख्या 2019 आर 1 ए 2 सी 1088909)। हम ट्रांसजेनिक चूहों को प्रदान करने के लिए जैविक विज्ञान विभाग, केएआईएसटी, डेजियोन, कोरिया में सेउंग-ही ली की प्रयोगशाला का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| 5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
| Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
| Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
| Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
| Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
| Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
| Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
| Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
| LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
| MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
| Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
| Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm |
| PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
| Photodiode | Thorlabs | S121C | |
| power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
| Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
| Prism | GraphPad | 5.01 version | |
| Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
| screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
| Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
| Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
| suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
| Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
| Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |
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