Här presenterar vi tillverkningsmetoden för ett optrodsystem med optiska fibrer för ljusleverans och en elektroduppsättning för neural inspelning. In vivo-experiment med transgena möss som uttrycker channelrhodopsin-2 visar systemets genomförbarhet för samtidig optogenetisk stimulering och elektrofysiologisk registrering.
Under det senaste decenniet har optogenetik blivit ett viktigt verktyg för undersökning av neural signalering på grund av dess unika förmåga till selektiv neural modulering eller övervakning. Eftersom specifika typer av neuronala celler kan modifieras genetiskt för att uttrycka opsinproteiner, möjliggör optogenetik optisk stimulering eller hämning av de valda neuronerna. Det har skett flera tekniska framsteg inom det optiska systemet för optogenetik. Nyligen föreslogs att kombinera den optiska vågledaren för ljusleverans med elektrofysiologisk inspelning för att samtidigt övervaka de neurala svaren på optogenetisk stimulering eller hämning. I denna studie utvecklades en implanterbar optroduppsättning (2×2 optiska fibrer) med inbäddade flerkanaliga elektroder.
En lysdiod (LED) användes som ljuskälla, och en mikrofabricerad mikrolinsuppsättning integrerades för att ge tillräcklig ljuskraft vid spetsen av de optiska fibrerna. Optrode array-systemet består av engångsdelen och den återanvändbara delen. Engångsdelen har optiska fibrer och elektroder, medan den återanvändbara delen har LED och elektroniska kretsar för ljusstyrning och neural signalbehandling. Den nya designen av det implanterbara optrod-arraysystemet introduceras i den medföljande videon utöver proceduren för optrodimplantationskirurgi, optogenetisk ljusstimulering och elektrofysiologisk neural inspelning. Resultaten av in vivo-experiment visade framgångsrikt tidslåsta neurala spikar som framkallades av ljusstimuli från hippocampus excitatoriska neuroner hos möss.
Inspelning och kontroll av neural aktivitet är avgörande för att förstå hur hjärnan fungerar i ett neuralt nätverk och på cellulära nivåer. Konventionella elektrofysiologiska inspelningsmetoder inkluderar patchklämman 1,2,3,4 med användning av en mikropipett och extracellulär inspelning med mikroneuralelektroder 5,6,7,8. Som en neuromoduleringsmetod har elektrisk stimulering ofta använts för att direkt stimulera en fokal hjärnregion genom direkt eller indirekt depolarisering av neuronala celler. Den elektriska metoden kan emellertid inte skilja neuronala celltyper för inspelning eller stimulering eftersom de elektriska strömmarna sprids i alla riktningar.
Som en framväxande teknik har optogenetik inlett en ny era för att förstå hur nervsystemet fungerar 9,10,11,12,13,14,15,16. Kärnan i optogenetiska tekniker är att använda ljus för att kontrollera aktiviteten hos ljuskänsliga opsinproteiner uttryckta av genetiskt modifierade celler. Optogenetik möjliggör således sofistikerad modulering eller övervakning av genetiskt utvalda celler i komplicerade neurala kretsar14,17. Den bredare användningen av det optogenetiska tillvägagångssättet har krävt samtidig neural inspelning för att direkt bekräfta optisk neuromodulering. Därför skulle en integrerad enhet med ljusstyrnings- och inspelningsfunktioner vara extremt värdefull 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Det finns begränsningar för konventionell, laserbaserad optogenetisk stimulering, vilket kräver ett skrymmande och dyrt ljusleveranssystem 26,27,28,29,30. Därför använde vissa forskargrupper μLED-baserade kiselprober för att minimera storleken på ljusleveranssystemet 31,32,33,34. Emellertid, Det finns en risk för termisk hjärnskada orsakad av direktkontakt med μLEDs på grund av lysdiodernas låga enomvandlingseffektivitet. Lätta vågledare, såsom optiska fibrer, SU-8 och kiseloxynitrid (SiON), har applicerats för att undvika termisk skada 30,35,36,37,38,39. Emellertid, denna strategi har också en nackdel på grund av dess låga kopplingseffektivitet mellan ljuskällor och vågledarna.
Mikrolinsarrayen introducerades tidigare för att förbättra ljuskopplingseffektiviteten mellan lysdioder och optiska fibrer40. Ett optrodsystem utvecklades baserat på mikroelektromekaniska system (MEMS) för optisk stimulering och elektrisk inspelning på mikroskala40. Mikrolensuppsättningen mellan en LED och optiska fibrer ökade ljuseffektiviteten med 3,13 dB. Som visas i figur 1 är en 2×2 optisk fibermatris inriktad på 4×4 mikrolens array, och lysdioden är placerad under mikrolens array. De 2×2 optiska fibrerna är monterade istället för 4×4 för att minska hjärnskador. En volframelektroduppsättning är placerad intill optrodmatrisen med användning av kisel via hål för elektrofysiologisk inspelning (figur 1B).
Systemet består av en övre engångsdel och avtagbara bottendelar. Den övre engångsdelen, som inkluderar den optiska fiberuppsättningen, mikrolensuppsättningen och volframelektroduppsättningen, är utformad för att implanteras permanent i hjärnan för in vivo-experiment . Den nedre delen innehåller en LED-ljuskälla och en extern strömförsörjningsledning, som lätt kan tas bort och återanvändas för ett annat djurförsök. Ett fästbart plastlock skyddar engångsdelen när den avtagbara delen tas bort.
Systemets genomförbarhet verifieras genom implantation i hjärnan hos transgena möss som uttrycker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2+/kalmodulinberoende proteinkinas II-positiva nervceller (CaMKIIα::ChR2 mus). Inspelningselektroder användes för att registrera neurala aktiviteter från enskilda neuroner under optisk stimulering av neuronerna.
Systemets genomförbarhet för samtidig optogenetisk stimulering och elektrofysiologisk registrering verifierades (figur 6). De stora spikarna under ljusstimulering är fotoelektriska artefakter som uppträder samtidigt som ljusstimuleringen (figur 6A). Detta är tydligt i den zoomade vyn av vågformen i den röda streckade rektangeln (figur 6A). Som visas i figur 6A kunde de fotoelektriska artefakterna…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation genom National Research Foundation of Korea (NRF), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2019M3C1B8090805), och stöds av ett National Research Foundation of Korea (NRF) -bidrag finansierat av Koreas regering (MSIT) (nr 2019R1A2C1088909). Vi tackar Seung-Hee Lees laboratorium vid Institutionen för biologiska vetenskaper, KAIST, Daejeon, Korea, för att de vänligen tillhandahåller de transgena mössen.
5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm |
PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
Photodiode | Thorlabs | S121C | |
power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
Prism | GraphPad | 5.01 version | |
Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |