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Neurosciences

Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

Published: September 01, 2022
doi:
10.3791/63460
, , , , , , ,
1Department of Electronic and Electrical Engineering,Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory,Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice,Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences,Ewha Womans University

Summary

Aquí, presentamos el método de fabricación de un sistema optrode con fibras ópticas para la entrega de luz y una matriz de electrodos para la grabación neuronal. Los experimentos in vivo con ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 muestran la viabilidad del sistema para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico.

Abstract

Durante la última década, la optogenética se ha convertido en una herramienta esencial para la investigación de la señalización neuronal debido a su capacidad única de modulación o monitoreo neuronal selectivo. Como tipos específicos de células neuronales pueden modificarse genéticamente para expresar proteínas opsina, la optogenética permite la estimulación óptica o la inhibición de las neuronas seleccionadas. Ha habido varios avances tecnológicos en el sistema óptico para la optogenética. Recientemente, se propuso combinar la guía de onda óptica para la entrega de luz con el registro electrofisiológico para monitorear simultáneamente las respuestas neuronales a la estimulación o inhibición optogenética. En este estudio, se desarrolló una matriz optrode implantable (fibras ópticas 2×2) con electrodos multicanal integrados.

Se empleó un diodo emisor de luz (LED) como fuente de luz, y se integró una matriz de microlentes microfabricadas para proporcionar suficiente potencia de luz en la punta de las fibras ópticas. El sistema optrode array comprende la parte desechable y la parte reutilizable. La parte desechable tiene fibras ópticas y electrodos, mientras que la parte reutilizable tiene el LED y los circuitos electrónicos para el control de la luz y el procesamiento de la señal neuronal. El novedoso diseño del sistema de matriz optrode implantable se introduce en el video adjunto, además del procedimiento de la cirugía de implantación optrode, la estimulación optogenética de la luz y el registro neuronal electrofisiológico. Los resultados de los experimentos in vivo mostraron con éxito picos neuronales bloqueados en el tiempo evocados por los estímulos de luz de las neuronas excitadoras del hipocampo de ratones.

Introduction

Registrar y controlar la actividad neuronal es esencial para comprender cómo funciona el cerebro en una red neuronal y a nivel celular. Los métodos convencionales de registro electrofisiológico incluyen la pinza de parche 1,2,3,4 utilizando una micropipeta y el registro extracelular utilizando electrodos microneurales 5,6,7,8. Como método de neuromodulación, la estimulación eléctrica se ha utilizado con frecuencia para estimular directamente una región focal del cerebro a través de la despolarización directa o indirecta de las células neuronales. Sin embargo, el método eléctrico no puede distinguir los tipos de células neuronales para el registro o la estimulación porque las corrientes eléctricas se propagan en todas las direcciones.

Como tecnología emergente, la optogenética ha marcado el comienzo de una nueva era en la comprensión de cómo funciona el sistema nervioso 9,10,11,12,13,14,15,16. La esencia de las técnicas optogenéticas es utilizar la luz para controlar la actividad de las proteínas opsina sensibles a la luz expresadas por células modificadas genéticamente. Así, la optogenética permite la modulación o monitorización sofisticada de células seleccionadas genéticamente en circuitos neuronales complicados14,17. El uso más amplio del enfoque optogenético ha requerido la grabación neuronal simultánea para confirmar directamente la neuromodulación óptica. Por lo tanto, un dispositivo integrado con funciones de control de luz y grabación sería extremadamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Existen limitaciones de la estimulación optogenética convencional basada en láser, que requiere un sistema de suministro de luz voluminoso y costoso 26,27,28,29,30. Por lo tanto, algunos grupos de investigación emplearon sondas de silicio basadas en μLED para minimizar el tamaño del sistema de suministro de luz 31,32,33,34. Sin embargo, existe el riesgo de daño cerebral térmico causado por el contacto directo con μLED debido a la baja eficiencia de conversión de energía de los LED. Se han aplicado guías de onda de luz, como fibras ópticas, SU-8 y oxinitruro de silicio (SiON), para evitar daños térmicos 30,35,36,37,38,39. Sin embargo, esta estrategia también tiene un inconveniente debido a su baja eficiencia de acoplamiento entre las fuentes de luz y las guías de onda.

La matriz de microlentes se introdujo anteriormente para mejorar la eficiencia de acoplamiento de luz entre LED y fibras ópticas40. Se desarrolló un sistema optrode basado en tecnologías de sistemas microelectromecánicos (MEMS) para la estimulación óptica y el registro eléctrico a microescala40. La matriz de microlentes entre un LED y fibras ópticas aumentó la eficiencia de la luz en 3,13 dB. Como se muestra en la Figura 1, una matriz de fibra óptica 2×2 está alineada en la matriz de microlentes 4×4, y el LED se coloca debajo de la matriz de microlentes. Las fibras ópticas 2×2 se montan en lugar de 4×4 para reducir el daño cerebral. Una matriz de electrodos de tungsteno se coloca adyacente a la matriz optrode utilizando silicio a través de orificios para el registro electrofisiológico (Figura 1B).

El sistema consta de una parte superior desechable y partes inferiores desmontables. La parte superior desechable, que incluye la matriz de fibra óptica, la matriz de microlentes y la matriz de electrodos de tungsteno, está diseñada para implantarse permanentemente en el cerebro para experimentos in vivo . La parte inferior incluye una fuente de luz LED y una línea de fuente de alimentación externa, que es fácilmente extraíble y reutilizable para otro experimento con animales. Una cubierta de plástico acoplable protege la pieza desechable cuando se retira la pieza desmontable.

La viabilidad del sistema se verifica mediante la implantación en el cerebro de ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) en neuronas positivas para la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (ratón CaMKIIα::ChR2). Se utilizaron electrodos de grabación para registrar las actividades neuronales de neuronas individuales durante la estimulación óptica de las neuronas.

Protocol

El cuidado de los animales y los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Mujeres Ewha (no. 20-029). 1. Preparación de una matriz optrode (Figura 1 y Figura 2) Conecte fibras ópticas con la matriz de microlentes. Retire el recubrimiento de pasivación de la fibra óptica y c?…

Representative Results

El sistema optrode se fabrica con éxito para proporcionar suficiente potencia de luz para activar las neuronas objetivo. La alineación fina de los electrodos de tungsteno se logra a través del silicio microfabricado a través de los agujeros. La intensidad de luz medida es de 3,6 mW/mm2 en la punta de la fibra óptica cuando se aplica una corriente de 50 mA. La microlente aumentó la eficiencia lumínica en 3,13 dB. Debido a la matriz de microlentes, que mejora el acoplamiento de luz, la corriente aplicada …

Discussion

Se verificó la viabilidad del sistema de estimulación optogenética simultánea y registro electrofisiológico (Figura 6). Los grandes picos durante la estimulación de la luz son artefactos fotoeléctricos que ocurren al mismo tiempo que la estimulación de la luz (Figura 6A). Esto queda claro en la vista ampliada de la forma de onda en el rectángulo discontinuo rojo (Figura 6A). Como se muestra en la Figura…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por el Programa de I + D de Tecnología Convergente para el Aumento Humano a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2019M3C1B8090805), y apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (no. 2019R1A2C1088909). Agradecemos al laboratorio de Seung-Hee Lee en el Departamento de Ciencias Biológicas, KAIST, Daejeon, Corea, por proporcionar amablemente a los ratones transgénicos.

Materials

5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus
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Keywords: OptrodeOptogenetic ModulationElectrical Neural RecordingLED-based SystemMicrolens ArrayWireless SystemOptogeneticsSpinal Cord InjuryEpilepsyParkinson’s DiseaseAlzheimer’s DiseaseTungsten ElectrodesOptical FibersStereotactic FrameThermal Heating PadLidocaineCraniotomyGround Screw
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Citer Cet Article
Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C., Kim, Y., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).
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