Intensiv forberedelse af intakte mus cerebrale endotelrør fra cerebrale parenkymale arterioler er illustreret til at studere cerebral blodgennemstrømningsregulering. Desuden demonstrerer vi de eksperimentelle styrker ved denne endotelundersøgelsesmodel til fluorescensbilleddannelse og elektrofysiologisk måling af vigtige cellulære signalveje, herunder ændringer i intracellulær [Ca2+] og membranpotentiale.
Cerebral blodgennemstrømning formidles af vaskulære resistensarterier og nedstrøms parenkymale arterioler. Steady-state vaskulær resistens over for blodgennemstrømningen øges med faldende diameter fra arterier til arterioler, der i sidste ende føder ind i kapillærer. På grund af deres mindre størrelse og placering i parenchymen har arterioler været relativt underundersøgte og med mindre reproducerbarhed i fund end overfladepialarterier. Uanset hvad kræver arteriolær endotelcellestruktur og -funktion – integreret i fysiologien og ætiologien af kroniske degenerative sygdomme – omfattende undersøgelse. Især viser nye beviser, at kompromitteret endotelfunktion går forud for og forværrer kognitiv svækkelse og demens.
I parenkymal mikrocirkulation er endotel K + – kanalfunktion den mest robuste stimulus til fint at kontrollere spredningen af vasodilatation for at fremme stigninger i blodgennemstrømningen til områder med neuronal aktivitet. Dette papir illustrerer en raffineret metode til nyisolering af intakte og elektrisk koblede endotelrør (diameter, ~ 25 μm) fra musehjernens parenkymale arterioler. Arteriolære endotelrør sikres under fysiologiske forhold (37 ° C, pH 7,4) for at løse eksperimentelle variabler, der omfatter K + kanalfunktion og deres regulering, herunder intracellulær Ca2 + dynamik, ændringer i membranpotentiale og membranlipidregulering. En klar teknisk fordel i forhold til arterielt endotel er den forbedrede morfologiske opløsning af celle- og organelledimensioner (f.eks. Mitokondrier), hvilket udvider nytten af denne teknik. Sund cerebral perfusion gennem hele livet indebærer robust endotelfunktion i parenkymale arterioler, der direkte forbinder blodgennemstrømningen med brændstof til brændstof til neuronal og glial aktivitet gennem præcise anatomiske områder af hjernen. Det forventes således, at denne metode vil fremme den generelle viden om vaskulær fysiologi og neurovidenskab vedrørende den sunde og syge hjerne betydeligt.
Parenkymale arterioler leverer direkte essentiel ilt og næringsstoffer i hele hjernen1. Mens de er i grænseflade med kapillærer, reagerer stærkt vasoaktive arterioler på retrograd signalering initieret af kapillærionkanaler, der registrerer metaboliske signaler fra specifikke neuronale regioner2. Da hjerneparenkym historisk har modtaget størstedelen af undersøgelsen, er der nu opstået en rolle for endoteldysfunktion til afklaring af patologiske mekanismer forbundet med forskellige cerebrovaskulære lidelser, der ligger til grund for demens (f.eks. Iskæmisk slagtilfælde, Alzheimers sygdom)3,4,5,6 . Endotelet er integreret i perfusion af hjernen i overensstemmelse med heterogeniteten af genetik, struktur og funktion i hele vaskulære segmenter7. Pialarterier er blevet grundigt undersøgt på grund af deres relativt store størrelse, høje segmentale vaskulære resistens og rolle i blodgennemstrømningsfordelingen til det underliggende cerebrum 8,9. Således vil en bedre forståelse af arteriolære endotelmekanismer sandsynligvis forbedre forståelsen af hjernens blodgennemstrømningsregulering i sundhed og sygdom mod udviklingen af nye terapeutiske regimer.
Nye beviser fremhæver vigtigheden af at studere parenkymale arterioler i forhold til forskellige signalveje og sygdomme 8,10. Denne fremgangsmåde har imidlertid været begrænset til anvendelse af intakte trykarteriole11 og/eller kapillær-parenkymal arteriole (CaPA) præparater12. Nyligt isolerede, indfødte cerebrale arteriolære endotelceller uden andre celletyper og forvirrende faktorer er ikke blevet undersøgt, sandsynligvis på grund af tekniske vanskeligheder i deres isolation. Dette papir fremmer en tidligere teknik, der fremhæver isoleringen af pial arterielt endotel13 til nu pålideligt og reproducerbart at isolere endotelet af hjernens parenkymale arterioler (bredde: ~ 25 μm, længde: ~ 250 μm). Denne teknik hjælper med at opnå optimal opløsning af elektrisk og kemisk koblede celler i deres individuelle orientering og cellulære netværk.
Nøgleveje af interesse har inkluderet interaktionen mellem intracellulær Ca2+ ([Ca2+]i) signalering og hyperpolarisering af membranpotentiale (Vm) 14,15 – integreret i vasodilatation16 – for at tillade blod at komme ind i kapillærerne og levere ilt og næringsstoffer til aktivt parenkym17. Disse præparater muliggør elektrofysiologiske optagelser i realtid af ionkanaler, herunder Ca2+-permenante, forbigående receptorpotentiale (TRP) og K+-kanaler og/eller fluorescerende billeddannelse af intracellulære organeller i endotelcellerør under næsten fysiologiske forhold. Dette er en passende teknik for forskere, der er interesseret i fysiologiske cellulære mekanismer, der styrer endotelcellekontrol af cerebral blodgennemstrømning til hjernens parenchyma. Alt i alt vil denne teknik hjælpe forskere med bedre at forstå grundlæggende endotelsignalveje og netværkskommunikation af arterioler indlejret i hjerneparenkym, samtidig med at de behandler spørgsmål relateret til cerebrovaskulær fysiologi og patologi.
Voksende beviser tyder på, at cerebrovaskulær sygdom (CVD), aldring og Alzheimers sygdom er stærkt korrelerede og er et aktuelt emne for demensforskning 4,8,14,21. Det er således indlysende, at undersøgelser af det cerebrovaskulære netværk vil have en bred indvirkning på sundheden, samtidig med at de kræver fortsat omfattende undersøgelse under sygdomsforhold. Som et væsentligt punkt…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er blevet støttet af bevillinger fra National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 til EJB; R00HL140106 til PWP) og Alzheimers Association (AZRGD-21-805835 til PWP). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller Alzheimers Association.
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |