Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.
Cerebrale bloedstroom wordt getransporteerd door vasculaire weerstandsslagaders en stroomafwaartse parenchymale arteriolen. Steady-state vasculaire weerstand tegen de bloedstroom neemt toe met afnemende diameter van slagaders tot arteriolen die uiteindelijk in haarvaten worden gevoed. Vanwege hun kleinere omvang en locatie in het parenchym zijn arteriolen relatief onderbelicht en met minder reproduceerbaarheid in bevindingen dan oppervlaktepiale slagaders. Hoe dan ook, arteriolar endotheelcelstructuur en -functie – integraal onderdeel van de fysiologie en etiologie van chronische degeneratieve ziekten – vereist uitgebreid onderzoek. In het bijzonder toont opkomend bewijs aan dat een gecompromitteerde endotheelfunctie voorafgaat aan en verergert cognitieve stoornissen en dementie.
In de parenchymale microcirculatie is de endotheel K + -kanaalfunctie de meest robuuste stimulus om de verspreiding van vaatverwijding fijn te beheersen om een toename van de bloedtoevoer naar gebieden met neuronale activiteit te bevorderen. Dit artikel illustreert een verfijnde methode voor het vers isoleren van intacte en elektrisch gekoppelde endotheelbuizen (diameter, ~ 25 μm) van parenchymale arteriolen van muizenhersenen. Arteriolar endotheelbuizen worden gezekerd tijdens fysiologische omstandigheden (37 °C, pH 7,4) om experimentele variabelen op te lossen die de K + kanaalfunctie en hun regulatie omvatten, inclusief intracellulaire Ca2 + dynamiek, veranderingen in membraanpotentiaal en membraanlipideregulatie. Een duidelijk technisch voordeel ten opzichte van arterieel endotheel is de verbeterde morfologische resolutie van cel- en organel (bijv. Mitochondriën) dimensies, wat het nut van deze techniek uitbreidt. Gezonde cerebrale perfusie gedurende het hele leven brengt een robuuste endotheelfunctie in parenchymale arteriolen met zich mee, waarbij de bloedtoevoer direct wordt gekoppeld aan het voeden van neuronale en gliale activiteit in precieze anatomische gebieden van de hersenen. Er wordt dus verwacht dat deze methode de algemene kennis van vasculaire fysiologie en neurowetenschappen met betrekking tot de gezonde en zieke hersenen aanzienlijk zal bevorderen.
Parenchymale arteriolen leveren direct essentiële zuurstof en voedingsstoffen in de hersenen1. Tijdens interfacing met haarvaten reageren zeer vasoactieve arteriolen op retrograde signalering geïnitieerd door capillaire ionkanalen die metabole signalen van specifieke neuronale regio’s waarnemen2. Nu hersenparenchym historisch gezien het grootste deel van het onderzoek heeft ontvangen, is er nu een rol voor endotheeldisfunctie ontstaan voor het verduidelijken van pathologische mechanismen die verband houden met verschillende cerebrovasculaire aandoeningen die ten grondslag liggen aan dementie (bijv. Ischemische beroerte, de ziekte van Alzheimer)3,4,5,6 . Het endotheel is een integraal onderdeel van de perfusie van de hersenen in overeenstemming met de heterogeniteit van genetica, structuur en functie in vasculaire segmenten7. Piale slagaders zijn uitgebreid bestudeerd vanwege hun relatief grote omvang, hoge segmentale vasculaire weerstand en rol in de bloedstroomverdeling naar het onderliggende cerebrum 8,9. Een beter begrip van arteriolar endotheelmechanismen zal dus waarschijnlijk het begrip van de regulering van de bloedstroom in de hersenen in gezondheid en ziekte verbeteren in de richting van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische regimes.
Opkomend bewijs benadrukt het belang van het bestuderen van parenchymale arteriolen in relatie tot verschillende signaalroutes en ziekten 8,10. Deze benadering is echter beperkt gebleven tot het gebruik van intacte arteriole11 onder druk en/of capillair-parenchymale arteriole (CaPA) preparaten12. Vers geïsoleerde, inheemse cerebrale arteriolar endotheelcellen zonder andere celtypen en verstorende factoren zijn niet onderzocht, waarschijnlijk als gevolg van technische problemen bij hun isolatie. Dit artikel bevordert een eerdere techniek die de isolatie van piaal arterieel endotheel13 benadrukt om nu betrouwbaar en reproduceerbaar het endotheel van hersenparenchymale arteriolen te isoleren (breedte: ~ 25 μm, lengte: ~ 250 μm). Deze techniek helpt bij het bereiken van een optimale resolutie van elektrisch en chemisch gekoppelde cellen in hun individuele oriëntatie en cellulaire netwerken.
Belangrijke routes van belang zijn de interactie van intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]i) signalering en hyperpolarisatie van membraanpotentiaal (Vm)14,15 – integraal voor vaatverwijding16 – om bloed in de haarvaten te laten komen en zuurstof en voedingsstoffen te leveren aan actief parenchym17. Deze preparaten maken real-time elektrofysiologische opnames van ionkanalen mogelijk, waaronder Ca2+-permeant, transient receptor potential (TRP) en K+ kanalen en/of fluorescerende beeldvorming van intracellulaire organellen in endotheelcelbuizen in bijna fysiologische omstandigheden. Dit is een geschikte techniek voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in fysiologische cellulaire mechanismen die de controle van endotheelcellen van cerebrale bloedstroomafgifte aan het hersenparenchym regelen. Al met al zal deze techniek onderzoekers helpen fundamentele endotheelsignaleringsroutes en netwerkcommunicatie van arteriolen ingebed in hersenparenchym beter te begrijpen, terwijl vragen met betrekking tot cerebrovasculaire fysiologie en pathologie worden aangepakt.
Groeiend bewijs suggereert dat cerebrovasculaire ziekte (CVD), veroudering en de ziekte van Alzheimer sterk gecorreleerd zijn en een actueel onderwerp zijn van dementieonderzoek 4,8,14,21. Het is dus duidelijk dat studies van het cerebrovasculaire netwerk een brede impact op de gezondheid zouden hebben, terwijl voortdurend uitgebreid onderzoek tijdens ziekteomstandigheden vereist is. Als een be…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek is ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 aan EJB; R00HL140106 aan PWP) en de Alzheimer’s Association (AZRGD-21-805835 aan PWP). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health of de Alzheimer’s Association.
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |