마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석
Summary
대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 “튜브”의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.
Abstract
대뇌 혈류는 혈관 저항성 동맥과 하류 실질 세동맥에 의해 전달된다. 혈류에 대한 정상 상태 혈관 저항은 궁극적으로 모세 혈관으로 공급되는 동맥에서 세동맥까지 직경이 감소함에 따라 증가합니다. 실질의 크기와 위치가 작기 때문에 세동맥은 상대적으로 과소 연구되었으며 표면 경동맥보다 소견에서 재현성이 떨어집니다. 그럼에도 불구하고, 동맥 내피 세포 구조와 기능 – 만성 퇴행성 질환의 생리학 및 병인학에 필수적인 – 광범위한 조사가 필요합니다. 특히, 새로운 증거는 손상된 내피 기능이인지 장애와 치매보다 선행하고 악화된다는 것을 보여줍니다.
실질 미세 순환에서 내피 K + 채널 기능은 신경 활동 영역으로의 혈류 증가를 촉진하기 위해 혈관 확장의 확산을 미세하게 조절하는 가장 강력한 자극입니다. 이 논문은 마우스 뇌 실질 세동맥으로부터 온전하고 전기적으로 결합된 내피 “튜브”(직경, ∼25 μm)를 신선하게 분리하기 위한 정제된 방법을 예시한다. 동맥 내피 튜브는 생리적 조건 (37°C, pH 7.4) 동안 확보되어 세포내Ca2+ 역학, 막 전위의 변화 및 막 지질 조절을 포함한 K+ 채널 기능 및 그 조절을 포괄하는 실험 변수를 해결합니다. 동맥 내피에 비해 뚜렷한 기술적 이점은 세포 및 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아) 치수의 향상된 형태 학적 분해능이며,이 기술의 유용성을 확장시킨다. 평생 동안 건강한 대뇌 관류는 실질 세동맥의 강력한 내피 기능을 수반하며, 혈류를 뇌의 정확한 해부학 적 영역에 걸쳐 신경 및 신경교 활동의 촉진과 직접 연결합니다. 따라서이 방법은 건강하고 병든 뇌에 관한 혈관 생리학 및 신경 과학에 대한 일반적인 지식을 상당히 발전시킬 것으로 예상됩니다.
Introduction
실질 세동맥은 뇌 전체에 필수 산소와 영양소를 직접 전달합니다1. 모세혈관과 상호 작용하는 동안, 고도로 혈관 활성 세동맥은 특정 신경 영역으로부터의 대사 신호를 감지하는 모세관 이온 채널에 의해 개시되는 역행 신호전달에 반응한다2. 뇌 실질이 역사적으로 많은 조사를 받음에 따라, 치매의 기초가되는 다양한 뇌 혈관 장애 (예 : 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 병)와 관련된 병리학 적 메커니즘을 명확히하기위한 내피 기능 장애의 역할이 등장했습니다.3,4,5,6 . 내피는 혈관 세그먼트 전반에 걸쳐 유전학, 구조 및 기능의 이질성에 따라 뇌의 관류에 필수적입니다7. Pial 동맥은 상대적으로 큰 크기, 높은 분절 혈관 저항성 및 기저 대뇌 8,9로의 혈류 분포의 역할로 인해 광범위하게 연구되었습니다. 따라서, 동맥 내피 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 새로운 치료 요법의 개발을 향한 건강 및 질병에서의 뇌 혈류 조절에 대한 이해를 향상시킬 것입니다.
새로운 증거는 다른 신호 전달 경로 및 질병 8,10과 관련하여 실질 세동맥을 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. 그러나, 이러한 접근법은 무손상 가압된 세동맥(11) 및/또는 모세관-실질 세동맥(CaPA) 제제(12)를 사용하는 것으로 제한되었다. 갓 분리된, 다른 세포 유형 및 교란 요인이 결여된 원시적 대뇌 동맥 내피 세포는 그들의 분리에 있어서 기술적인 어려움 때문에 검사되지 않았다. 이 논문은 pial 동맥 내피13의 분리를 강조하는 이전 기술을 발전시켜 뇌 실질 세동맥의 내피를 안정적이고 재현 가능하게 분리합니다 (폭 : ~ 25 μm, 길이 : ~ 250 μm). 이 기술은 개별 방향 및 세포 네트워크에서 전기적, 화학적으로 결합 된 세포의 최적 분해능을 달성하는 데 도움이됩니다.
관심의 주요 경로에는 세포 내 Ca2+ ([Ca2+]i) 신호 전달의 상호 작용과 혈관 확장에 필수적인 막 전위 (Vm) 14,15 (혈관 확장에 필수적 임)14,15의 과분극이 포함되어있어 혈액이 모세 혈관에 들어가고 활성 실질에 산소와 영양소를 전달할 수 있습니다 17. 이러한 제제는Ca2+-투과, TRP(transient receptor potential) 및 K+ 채널 및/또는 거의 생리학적 조건에서 내피 세포관 내의 세포내 소기관의 형광 이미징을 포함하는 이온 채널의 실시간 전기생리학적 기록을 허용한다. 이것은 뇌 실질로의 대뇌 혈류 전달의 내피 세포 조절을 지배하는 생리적 세포 메커니즘에 관심이있는 연구자들에게 적합한 기술입니다. 전체적으로,이 기술은 연구자가 뇌 혈관 생리학 및 병리학과 관련된 질문을 해결하면서 뇌 실질에 내장 된 세동맥의 근본적인 내피 신호 전달 경로 및 네트워크 통신을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Protocol
실험자는 동물 및 관련 프로토콜의 지정된 사용이 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받고 국가 연구위원회의 “실험실 동물의 관리 및 사용 가이드”(8th Edition, 2011) 및 ARRIVE 지침에 따라 수행되도록해야합니다. Loma Linda University와 University of Arizona의 IACUC는 C57BL / 6N 및 3xTg-AD 마우스 (남성과 여성, 연령대 : 2-30 개월)에 대한이 원고에 사용되는 모든 프로토콜을 승인했습니?…
Representative Results
프로토콜의 데모는 각각 도 2 및 도 3과 같이 동맥 박리 및 내피관 분리 단계를 갖는 도 1에 도시되어 있다. 여기서, 내피 기능은 37°C에서 약리학적 제제[2-메틸티오아데노신 디포스페이트(MTA), 강력한 퓨리네르성 수용체(P2YR) 작용제]에 반응하여 Fura-2 광도계 및 샤프 전극 전기생리학(도 4A)을 사용하여 [</s…
Discussion
성장하는 증거는 뇌 혈관 질환 (CVD), 노화 및 알츠하이머 병이 강하게 상관 관계가 있으며 치매 연구4,8,14,21의 현재 주제임을 시사합니다. 따라서 뇌 혈관 네트워크에 대한 연구가 건강에 광범위한 영향을 미치면서 질병 상태 동안 지속적인 광범위한 조사가 필요하다는 것은 분명합니다. 뇌 관류에 대…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (R00AG047198 & R56AG062169)의 보조금으로 EJB에 지원되었습니다. R00HL140106 내지 PWP) 및 알츠하이머 협회(AZRGD-21-805835 내지 PWP). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 또는 알츠하이머 협회의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
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Citer Cet Article
Hakim, M. A., Pires, P. W., Behringer, E. J. Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (181), e63463, doi:10.3791/63463 (2022).