Descemet’s Stripping Only er en eksperimentel procedure, hvor patienter med central hornhinde guttae som følge af Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy får Descemets membran strippet for perifere celler for at regenerere endotellaget. Vi præsenterer en ny metode, der simulerer DSO i dystrofiske humane hornhinden ex vivo med accelereret heling stimuleret af eFGF1 (NM141).
Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) skyldes dysfunktionelle hornhindeendotelceller (CEC’er) og behandles i øjeblikket ved transplantation af hele hornhinden eller Descemets membran. Den seneste udvikling inden for okulær kirurgi har etableret Descemet’s Stripping Only (DSO), en kirurgisk teknik, hvor en central cirkel af guttae-tæt Descemets membran fjernes for at muliggøre migration af CEC’er på den glatte stroma, genoprette funktion og vision til hornhinden. Mens denne potentielle behandlingsmulighed er af stor interesse inden for oftalmisk forskning, er der ikke etableret nogen vellykkede ex vivo-modeller af DSO, og kliniske data er begrænsede. Dette arbejde præsenterer en ny sårhelende model, der simulerer DSO i humane donorhornhindene. Ved hjælp af denne tilgang til at evaluere effekten af den menneskekonstruerede FGF1 (NM141) fandt vi, at behandlingen fremskyndede helingen via stimulering af migration og spredning af CEC’er. Dette fund blev bekræftet i 11 par humane hornhindene med tegn på dystrofi rapporteret af øjenbankerne for at verificere, at disse resultater kan replikeres hos patienter med Fuchs ‘dystrofi, som målpopulationen for DSO-proceduren.
Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) er en sygdom, der er karakteriseret ved tabt pumpefunktion i hornhindeendotelceller (CEC’er) og overdreven opbygning af kollagen og andre ekstracellulære matrixproteiner på overfladen af Descemets membran, der danner hornhinde guttae1. Den eneste kendte behandling for FECD er endotelkeratoplastik i forskellige former, som alle har risiko for afstødning og endotelcelletab2. Mens fremskridt inden for oftalmisk kirurgi har gjort det muligt for disse procedurer at blive mindre invasive over tid, kommer enhver form for transplantation med risiko for afvisning og mulighed for livstid steroidbrug, en behandling med sine egne samtidige bivirkninger. Desuden er den globale mangel på donorvæv sådan, at der kun er én donorhornhinde til rådighed for hver 70 patienter med behov3. I betragtning af disse udfordringer undersøger forskere og klinikere kirurgiske metoder, der helt undgår behovet for donorvæv. En af disse eksperimentelle teknikker er Descemet’s Stripping Only (DSO) eller Descemetorhexis uden Endothelial Keratoplasty (DWEK), hvor FECD-patienter med guttae lokaliseret til midten af hornhinden har en central 4 mm cirkel af Descemets membran strippet uden transplantatplacering. Fjernelsen af guttae tilskynder sunde perifere celler til at migrere indad og reformere endotelmonolaget, til sidst vende stromalt ødem og forbedre synet. Konceptet blev oprindeligt beskrevet i en række casestudier, hvor patienter gennemgik kirurgi, der blev kompliceret af løsrivelse af Descemets membran, men CEC-repopulation forekom stadig 4,5,6,7. Selvom der er mange fordele ved denne metode, er helingsprocessen langvarig og inkonsekvent, da nogle patienter kræver redningstransplantation, hvis der ikke ses helbredelse i månederne efter operationen8. Af disse grunde kan et lægemiddel, der stimulerer hurtigere migration og spredning af CEC’er, være gavnligt i genopretningsprocessen for FECD-patienter, der har gennemgået DSO.
Flere nylige undersøgelser har evalueret ROCK-hæmmere som en supplerende behandling for patienter, der gennemgår DSO, og fundet ud af, at behandlede patienter kom sig hurtigere og havde højere centrale endotelcelletætheder (ECD) end dem i DSO-gruppenkun gruppe 9,10,11. På grund af små prøvestørrelser og forskelle mellem doseringsregimer er der imidlertid behov for flere data for bedre at forstå effekten af ROCK-hæmmere i denne indstilling.
Fibroblastvækstfaktorer har også vist sig at stimulere regenerering af hornhindeendotelet både in vitro med kvæg CIC’er og in vivo i kattehornherne12,13. eFGF1 (NM141) er en konstrueret version af FGF-1, der indeholder flere aminosyresubstitutioner for at stabilisere molekylet i modsætning til den oprindelige FGF-1, som har en meget kortere halveringstid 14,15. Vi har tidligere demonstreret eFGF1’s (NM141) evne til at stimulere spredning af CEC’er ex vivo i kvartede humane hornherne16. Denne undersøgelse søgte at forbedre dette arbejde ved at etablere den første vellykkede ex vivo-model af DSO i både normale og dystrofiske hornhindene for at afgøre, om supplerende behandlinger som eFGF1 (NM141) fremskynder helingen i denne applikation.
Mange øjenlæger er bekymrede for at anbefale DSO til deres patienter af to hovedårsager: 1) den langvarige helingsproces og 2) mangel på data (DSO er et nyt koncept inden for oftalmisk kirurgi). Den forskning, vi har præsenteret, ville være til stor nytte for at lette begge disse bekymringer. Baseret på data fra dette studie og andre har FDA godkendt et klinisk fase 2-forsøg, hvor eFGF1 (NM141) vil blive administreret ved forskellige doseringsplaner til patienter, der gennemgår DSO17.
Metoden beskrevet ovenfor blev modelleret efter en undersøgelse udført af Soh et al., hvor hornhindeendotelheling blev evalueret med og uden ROCK-hæmmeren Y-27632 i både ridsede og skrællede sår18. Mens Y-27632 accelererede endotelregenerering med Descemets membran stadig intakt, blev der ikke fundet nogen væsentlig heling i strippede sår, selv med behandling. Ved hjælp af en lignende strippeteknik efterfulgt af behandling med eller uden eFGF1 (NM141) var de observationer, vi fandt, ikke i overensstemmelse med Soh og kollegers. Fraværet af Trypan Blue-farvning i mange behandlede hornhinden på dag 14 og tilstedeværelsen af ZO-1-positive tætte kryds inden for det reformerede endotellag hævder, at en intakt barriere, en del af CEC’s naturlige funktion, blev genoprettet i både normale og dystrofiske hornhindene. Selvom det ikke er kvantificeret i denne undersøgelse, antyder tilstedeværelsen af EdU-positive celler i og omkring det strippede område også spredning som en helingsmekanisme, som vi tidligere har fastslået kan stimuleres af eFGF1 (NM141) i skadede hornhindene16. Statistisk analyse viste, at behandling med eFGF1 (NM141) resulterede i signifikant større heling fra DSO, i gennemsnit over dobbelt så høj som kontrolhornherne på 14-dages tidspunktet. Selvom helingshastighederne varierer moderat mellem individer – et typisk kendetegn ved donorhornhindene – viser resultaternes replikabilitet over store prøvestørrelser også en meget målbar metode. Så vidt vi ved, er der ingen andre eksempler på en ex vivo Descemets strippemodel i litteraturen.
Nøglekomponenter i selve protokollen, der ville tjene værdifuldt for andre forskere, der studerer DSO, er brugen af Trypan Blue til at detektere bar stroma og billedbehandlingsteknikken, der bruges til at måle det farvede område. Trypan Blue er almindeligt anvendt i oftalmisk kirurgi, især når man arbejder med Descemets membran for at detektere ikke-levedygtige celler og hjælpe med synlighed af vævet. De farvningstidspunkter, der er inkluderet i denne protokol, tillod effektiv gentagen farvning uden at udsætte hornhinderne for Trypan Blue, da det har vist sig at være giftigt for CEC’er i høje koncentrationer19. Reduktionen af farvet areal over 14 dage i alle hornhindene, bekræftet af Alizarin Red og immunohistokemi at være resultatet af migrerede CEC’er, viser en enkel og reproducerbar metode til måling af heling. Ved hjælp af ImageJ’s farvetærskelmenu indsamlede flere analytikere data med standardafvigelser konsekvent under 1% (data vises ikke). Selvom alternative programmer kan fungere på samme måde, er ImageJ en open source-software, der er i stand til at producere nøjagtige områdemålinger for at spore helbredelse.
Der er dog et aspekt af stripningsprotokollen, som vi fandt både nødvendigt for sårskabelse, men alligevel hindrende for den samlede helingsproces. Brug af en skarp 30 G-nål til at score Descemets membran langs det mærke, der efterlades af biopsistansen, muliggør skabelsen af et glat, cirkulært sår, som klinikere bemærker for at understøtte hurtigere heling10. Samtidig er dette trin skadeligt for hornhinden, da det kan skabe tårer i stromalfibrene, der forårsager stromal celledød, hindrer migration af endotelceller over sårkanten og inducerer dannelsen af knuder, der resulterer i mere vedvarende postoperativt ødem20. Klinikere, der udfører DSO, bruger typisk en omvendt Sinskey-krog til at starte såret, men uden noget intraokulært tryk, der holder hornhinden stram, er dette værktøj mindre effektivt i ex vivo-modellen . Et alternativt værktøj, der er i stand til at rive Descemets membran uden at beskadige den underliggende stroma, ville forbedre protokollen, for eksempel vandings- og aspirationshåndstykket, der anbefales af Macsai og Shiloach10. Yderligere eksperimenter vil være nødvendige for at afgøre, om denne teknik er kompatibel med ex vivo-modellen .
En udfordring, der synes at være forbundet med ex vivo-modellen, er den hyppige forekomst af CEC-død i det område, der er perifert for såret, især i dystrofiske hornhindene. Denne lejlighedsvis skjulte kvantation af sårområdet, da nøjagtigheden af farvetærskelværktøjet bliver mere begrænset, da det farvede område strækker sig ud over hornhindens centrum, hvor dets krumning resulterer i ujævn lysfordeling. Disse variable målinger fandt dog primært sted på tidligere tidspunkter, før perifer farvning gradvist trak sig tilbage, da beskadigede CEC’er ryddede og naboceller strakte sig, migrerede eller spredte sig for at erstatte dem. Ved det sidste 14 dages tidspunkt var det farvede område lokaliseret tilbage til midten af hornhinden, og alle billeder var målbare. En lignende observation blev gjort med sammenlignelig frekvens af Soh et al., hvor fem af 14 normale hornhindene præsenterede, hvad de kaldte ‘Premature Culture Failure’ (PCF) tidligt i kulturperioden18. Mens skaden vendte sig over tid i vores hornhinden og alligevel var permanent i deres tilfælde, kan dette tilskrives det faktum, at deres metode krævede at såre et større område af hornhinden. Observationen af mere udbredt perifer Trypan-farvning i dystrofiske hornhindene kan indikere, at dystrofiske hornhindene er mere modtagelige for endotelcelledød end sunde hornhindene. Mens den nøjagtige årsag til denne celledød endnu ikke er belyst, mener vi, at det er usandsynligt, at dette spørgsmål vil være relevant for menneskelige hornhinden in vivo. Skader på det perifere endotel er ikke rapporteret i nogen kliniske casestudier af DSO til vores viden, hvilket tyder på, at dette fænomen er unikt for donorhornhinden dyrket ex vivo 6,8,10,11,21. Bortset fra to tilfælde, hvor kun kontrolhornhinden var farvet, blev alle observationer af perifer farvning parret, så det er usandsynligt, at årsagen var eksponering for eFGF1 (NM141). Det er imidlertid muligt, at behandlingen i disse tilfælde kan have givet en beskyttende virkning mod den skade, der ellers ville have fremkaldt perifer farvning i begge hornhindene. Yderligere undersøgelse af denne hypotese er nødvendig.
En anden begrænsning af denne metode er sourcing af donorhornhiner, der er repræsentative for FECD-fænotypen, som DSO er beregnet til. Donorhornhindene af enhver art er knappe, og derfor er der behov for en operation, der undgår brugen af donorvæv. Til vores formål er de eneste hornhhorn, der er tilgængelige, dem, der afvises fra transplantation af forskellige årsager. Øjenbanker klassificerer yderligere disse hornhinden som normale eller dystrofiske baseret på kriterier, herunder tilstedeværelse af guttae, lavt eller ikke-målbart ECD og uregelmæssig CEC-morfologi. Bekræftelse af en dystrofisk diagnose inden accept af væv fra en øjenbank er også næsten umulig, da de fleste donorers sygehistorie ikke omfatter tidligere okulær historie, og de eneste oplysninger, der gives, er ECD-værdien, teknikerens noter og i nogle tilfælde et repræsentativt spekulært billede. De dystrofiske hornhindene opnået til denne undersøgelse viste ikke sammenflydende central guttae ved konfokal mikroskopi udført efter dyrkningsperioden var afsluttet, hvilket tyder på, at de kan repræsentere “tidlige” stadier af FECD. Vi forventer ikke, at dette vil have en væsentlig indvirkning på konsekvenserne af undersøgelsen, da formålet med DSO er at fjerne sammenflydende områder af guttae, så sunde perifere celler kan migrere indad.
Denne metode giver en meget anvendelig og reproducerbar teknik til evaluering af agenser, der kan påvirke CEC-spredning og migration. Modellen har flere funktioner, der gør den mere fysiologisk relevant end in vitro-modeller, der involverer dyrkede CEC’er, selv når den sås på humant hornhindevævstransplantat 22,23,24. For det første er de CEC’er, der skal stimuleres, i et monolag, nøjagtigt som de findes i patientens øje, og migrerer over hornhindestromaen, som de ville efter klinisk DSO. Den pågældende stroma er fra samme patient som CEC’erne og kontrollerer således for potentielle FECD-relaterede stromalforskelle. Der er ingen grund til at udplante, dissociere og udvide kulturer af CEC’er med de tilhørende udfordringer og potentiale for Endothelial to Mesenchymal Transition (EnMT) under dyrkningsprocessen. Den beskrevne protokol ligner i sig selv meget den kliniske DSO-procedure. Selvom det omgår kultur- og ekspansionstrinnene, har denne metode den begrænsning, at undersøgelsens varighed er begrænset af hornhindehævelse, da epitellaget ikke opretholdes. Dette forhindrer os i at undersøge morfologien af CEC’er, der er migreret for at dække det strippede område, hvilket efterlader det uklart, om de til sidst vil omarrangere sig til et sekskantet array i denne model. Garcin et al. har udviklet en potentiel løsning med deres aktive opbevaringsmaskine (ASM), en enhed, der har vist sig at holde hornhinden i kultur i op til 3 måneder med betydeligt mindre ødem end hornhindene, der opretholdes i traditionel organkultur25. En sådan anordning kan være nyttig til at replikere og udvide dette arbejde.
Denne model har potentiel nytteværdi til at teste andre sårhelingsterapier (f.eks. ROCK-hæmmere), evaluere ændringer af kirurgisk teknik og sammenligne heling på tværs af forskellige donorpopulationer eller sygdomsstadier. Vi håber, at denne forskning sammen med kliniske forsøgsdata, når den kommer ud, tilskynder klinikere til at overveje DSO som en værdifuld behandlingsmulighed for deres kvalificerede FECD-patienter.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette arbejde blev støttet af Trefoil Therapeutics og NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Forfatterne vil gerne takke Tony Wong for histopatologiske råd og tjenester, Nikon Imaging Center ved UC San Diego for brug af deres konfokale mikroskop og Dr. Natalie Afshari og Marian Macsai for deres råd om kirurgisk teknik. Derudover udtrykker forfatterne deres taknemmelighed over for øjendonorerne og øjenbankerne for at have leveret hornhinden.
0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
Analytical balance | Sartorious | R200D | |
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |