Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

Résumé

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique d’imagerie puissante, non destructive et sans étiquette. Une application émergente est l’histologie Raman stimulée, où l’imagerie SRS bicolore aux transitions Raman protéique et lipidique est utilisée pour générer des images de pseudo-hématoxyline et d’éosine. Ici, nous démontrons un protocole pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel pour le diagnostic tissulaire.

Résumé

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est devenue une puissante technique d’imagerie optique pour le diagnostic des tissus. Au cours des dernières années, il a été démontré que le SRS bicolore était capable de fournir des images équivalentes à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) qui permettent un diagnostic rapide et fiable du cancer du cerveau. Cette capacité a permis des applications passionnantes de diagnostic peropératoire du cancer. L’imagerie SRS bicolore des tissus peut être effectuée avec une source laser picoseconde ou femtoseconde. Les lasers femtosecondes ont l’avantage de permettre des modes d’imagerie flexibles, y compris l’imagerie hyperspectrale rapide et l’imagerie SRS bicolore en temps réel. Une approche de focalisation spectrale avec des impulsions laser gazouillées est généralement utilisée avec les lasers femtosecondes pour atteindre une résolution spectrale élevée.

L’acquisition SRS bicolore peut être réalisée avec modulation orthogonale et détection de verrouillage. La complexité du gazouillis, de la modulation et de la caractérisation des impulsions est un goulot d’étranglement pour l’adoption généralisée de cette méthode. Cet article fournit un protocole détaillé pour démontrer la mise en œuvre et l’optimisation du SRS à focalisation spectrale et de l’imagerie bicolore en temps réel du tissu cérébral de souris en mode épi. Ce protocole peut être utilisé pour un large éventail d’applications d’imagerie SRS qui tirent parti de la capacité d’imagerie spectroscopique et à haute vitesse de SRS.

Introduction

Les diagnostics tissulaires traditionnels reposent sur des protocoles de coloration suivis d’un examen au microscope optique. Une méthode de coloration courante utilisée par les pathologistes est la coloration H & E: l’hématoxyline colore les noyaux cellulaires d’un bleu violacé, et l’éosine tache la matrice extracellulaire et le cytoplasme en rose. Cette simple coloration reste la référence en pathologie pour de nombreuses tâches de diagnostic tissulaire, en particulier le diagnostic du cancer. Cependant, l’histopathologie H & E, en particulier la technique de sectionnement congelé utilisée dans un cadre peropératoire, a encore des limites. La procédure de coloration....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été menées avec des cerveaux de souris fixes et sectionnés de 200 μm, conformément au protocole (# 4395-01) approuvé par l’Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Washington. Les souris de type sauvage (souche C57BL/6J) sont euthanasiées au CO₂. Ensuite, une craniotomie est effectuée pour extraire leur cerveau pour la fixation dans 4% de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate. Les cerveaux sont incorporés dans un mélange d’agarose à 3% et de gélatine à 0,3% et sectionnés en tranches de 200 μm d’épaisseur par un vibratome.

Résultats

Optimisation de la résolution spectrale :
La dispersion à travers un matériau est affectée par le milieu dispersif (longueur et matériau) et la longueur d’onde. La modification de la longueur de la tige de dispersion affecte la résolution spectrale et la taille du signal. Il s’agit d’une relation donnant-donnant qui peut être pesée différemment selon l’application. Les tiges étirent l’impulsion du faisceau d’être large en fréquence et étroite dans le temps à être étroite en fréquence et large dans le .......

Discussion

Le schéma d’imagerie SRS bicolore présenté dans ce protocole repose sur la mise en œuvre correcte de l’imagerie SRS monochrome. Dans l’imagerie SRS monochrome, les étapes critiques sont l’alignement spatial, l’alignement temporel, la profondeur de modulation et le déphasage. La combinaison spatiale des deux faisceaux est réalisée par un miroir dichroïque. Plusieurs rétroviseurs de direction sont utilisés pour un réglage fin lors de l’envoi des faisceaux au miroir dichroïque. Une fois les faisceaux combinés avec le miroir.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lentille achromatique 100 mm	THORLABS	AC254-100-B	Large bande, 650 - 1 050 nm, distance focale de l’objectif achromatique, 100 mm
Filtre passe-bande 20 MHz	Minicircuits	BBP-21.4+	Filtre passe-bande LC regroupé, 19,2 - 23,6 MHz, 50 & Omega ;
Lentille achromatique 200 mm	THORLABS	AC254-200-B	Large bande, 650 - 1 050 nm, distance focale de la lentille achromatique, 200 mm
Demi-plaque d’onde achromatique	Optic	WPA2210-650-1100-M25.4 Demi-plaque	d’onde large bande
Quart d’onde achromatique	Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Échantillonneur de faisceau quart d’onde large bande
	THORLABS	BSN11	10:90
Miroir dichroïque	THORLABS	DMSP1000	D’autres dichroïques avec une longueur d’onde centrale d’environ 1 000 nm peuvent être utilisés.
DMSO (Dimethyl sulfoxyde)	Sigma Aldrich	472301	Solvant pour l’étalonnage du décalage Raman. D’autres solvants avec des pics Raman connus peuvent être utilisés.
Modulateur d’amplitude électro-optique	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Deux EOM sont nécessaires pour la modulation orthogonale et l’imagerie à double canal. La version résonante est recommandée afin d’utiliser une tension d’entraînement plus faible.
Faux H& E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	Buffer 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, pour générer la fréquence d’entraînement EOM et la référence à la
photodiode rapide	Détecteur THORLABS	DET10A2	Si, 1 ns
Rise Time Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	Diviseur TTL Freq. (f/2, f/4, f/8, f/16), pour générer 20 MHz à partir de la sortie laser.
Tiges de verre hautement dispersives Union	Optic	CYLROD01	Haute dispersion H-ZF52A Lentille à tige 120 mm, SF11 Lentille à tige 100 mm
Insight DS+	Newport		Système laser capable de produire deux lasers pulsés synchronisés (un faisceau fixe à 1 040 nm et un faisceau accordable, allant de 680 à 1 300 nm) avec un taux de répétition de 80 MHz.
Amplificateur Lock-In Liquid Instruments		Moku Lab	Amplificateur Lock-in pour extraire le signal SRS de la photodiode. Un instrument Zurich Instrument HF2LI ou un instrument similaire peut également être utilisé.
Miroirs	THORLABS	BB05-E03-10	Miroir diélectrique à large bande, 750 - 1 100 nm. Des miroirs argentés peuvent également être utilisés.
Ecran de retard motorisé	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Ecran de retard pour le contrôle précis du chevauchement temporel de la pompe et des lasers Stokes. Toute autre scène motorisée devrait fonctionner.
Condenseur à immersion dans l’huile	Nikon	CSC1003	1.4 NA. D’autres condenseurs avec NA>1.2 peuvent être utilisés.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Tout autre oscilloscope avec une bande passante de 400 MHz ou plus devrait fonctionner.
Déphaseur	SigaTek	SF50A2	Pour le déphasage de la fréquence de modulation
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Diode PIN en silicium de grande surface (10 x 10 cm2). D’autres diodes de grande surface et de faible capacité peuvent être utilisées.
Séparateur de faisceau polarisant	Optic	PBS9025-620-1000	Base
de données			d’indices
réflecteur	Edmund Optics	34-408	BBAR Prisme à angle droit. D’autres prismes ou rétroréflecteurs peuvent être utilisés.
Minicircuits	d’amplificateur de puissance RF	ZHL-1-2W+	Bloc de gain, 5 - 500 MHz, 50 & Omega ;
Miroirs à balayage	Cambridge Technologies	6215H	Nous avons utilisé un ensemble de miroirs de 5 mm avec revêtement argenté
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser Logiciel de contrôle de microscope à balayage
Filtre passe-court	THORLABS	FESH1000	25,0 mm Filtre passe-court premium, longueur d’onde de coupure : 1 000 nm. Pour une suppression efficace des Stokes, deux filtres peuvent être nécessaires.
Microscope droit	Nikon	Eclipse FN1	N’importe quel autre cadre de microscope peut être utilisé. Si un microscope à balayage laser est disponible, il peut être utilisé directement. Sinon, il fallait ajouter un scanner galvo et un objectif de balayage au microscope.
Objectif d’immersion dans l’eau	Olympus	XLPLN25XWMP2	L’objectif multiphoton 25X a une NA de 1,05. D’autres objectifs similaires peuvent être utilisés.

Union Union verrouillable Union de réfaction refractiveindex.info