Realtid, tvåfärgad stimulerad Raman-spridningsavbildning av mushjärnan för vävnadsdiagnos

Summary

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi är en kraftfull, icke-destruktiv och etikettfri bildteknik. En framväxande tillämpning är stimulerad Raman-histologi, där tvåfärgad SRS-avbildning vid protein- och lipid Raman-övergångarna används för att generera pseudo-hematoxylin- och eosinbilder. Här demonstrerar vi ett protokoll för realtid, tvåfärgad SRS-avbildning för vävnadsdiagnos.

Abstract

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi har uppstått som en kraftfull optisk bildteknik för vävnadsdiagnos. Under de senaste åren har tvåfärgade SRS visat sig kunna ge hematoxylin och eosin (H & E) -ekvivalenta bilder som möjliggör snabb och tillförlitlig diagnos av hjärncancer. Sådan förmåga har möjliggjort spännande intraoperativa cancerdiagnosapplikationer. Tvåfärgad SRS-avbildning av vävnad kan göras med antingen en pikosekund eller femtosekund laserkälla. Femtosekundlasrar har fördelen att de möjliggör flexibla bildlägen, inklusive snabb hyperspektral avbildning och SRS-avbildning i realtid i två färger. En spektralfokuseringsmetod med chirped laserpulser används vanligtvis med femtosekundlasrar för att uppnå hög spektral upplösning.

Tvåfärgs SRS-förvärv kan realiseras med ortogonal modulering och inlåsningsdetektering. Komplexiteten i pulsklanderi, modulering och karakterisering är en flaskhals för det utbredda antagandet av denna metod. Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att demonstrera implementering och optimering av spektralfokuserande SRS och realtids, tvåfärgad avbildning av mushjärnvävnad i epi-läge. Detta protokoll kan användas för ett brett spektrum av SRS-bildapplikationer som utnyttjar SRS: s höghastighets- och spektroskopiska bildkapacitet.

Introduction

Traditionell vävnadsdiagnostik bygger på färgningsprotokoll följt av undersökning under ett optiskt mikroskop. En vanlig färgningsmetod som används av patologer är H & E-färgning: hematoxylin fläckar cellkärnor en purpurblå och eosin fläckar den extracellulära matrisen och cytoplasman rosa. Denna enkla färgning förblir guldstandarden inom patologi för många vävnadsdiagnosuppgifter, särskilt cancerdiagnos. H&E-histopatologi, särskilt den frysta sektioneringstekniken som används i en intraoperativ miljö, har dock fortfarande begränsningar. Färgningsförfarandet är en mödosam process som involverar vävnadsinbäddning, sektionering, fixering och färgning¹. Den typiska handläggningstiden är 20 minuter eller längre. Att utföra H&E under fryst sektionering kan ibland bli mer utmanande när flera sektioner bearbetas samtidigt på grund av behovet av att utvärdera cellulära funktioner eller tillväxtmönster i 3D för marginalbedömning. Dessutom kräver intraoperativa histologiska tekniker skickliga tekniker och kliniker. Begränsning av antalet styrelsecertifierade patologer på många sjukhus är i många fall en begränsning för intraoperativ konsultation. Sådana begränsningar kan lindras med de snabba utvecklingsintressena för digital patologi och artificiell intelligensbaserad diagnos². H&E-färgningsresultaten varierar dock beroende på teknikerns erfarenhet, vilket innebär ytterligare utmaningar för datorbaserad diagnos².

Dessa utmaningar kan potentiellt hanteras med etikettfria optiska bildtekniker. En sådan teknik är SRS-mikroskopi. SRS använder synkroniserade pulserade lasrar – pump och Stokes – för att excitera molekylära vibrationer med hög effektivitet³. Nya rapporter har visat att SRS-avbildning av proteiner och lipider kan generera H&E-ekvivalenta bilder (även känd som stimulerad Raman-histologi eller SRH) med intakt färsk vävnad, vilket kringgår behovet av vävnadsbehandling, förkortar avsevärt den tid som behövs för diagnos och har anpassats intraoperativt⁴. Dessutom kan SRS-avbildning ge 3D-bilder, vilket ger ytterligare information för diagnos när 2D-bilder är otillräckliga⁵. SRH är opartisk och genererar digitala bilder som är lättillgängliga för datorbaserad diagnos. Det framträder snabbt som en möjlig lösning för intraoperativ cancerdiagnos och tumörmarginalanalys, särskilt vid hjärncancer ^6,7,8. På senare tid har SRS-avbildning av kemiska förändringar i vävnad också föreslagits för att ge användbar diagnostisk information som ytterligare kan hjälpa kliniker att stratifiera olika cancertyper eller steg⁹.

Trots sin enorma potential i vävnadsdiagnosapplikationer är SRS-avbildning mestadels begränsad till akademiska laboratorier specialiserade på optik på grund av komplexiteten i samband med bildplattformen, som inkluderar ultrasnabba lasrar, laserskanningsmikroskopet och sofistikerad detektionselektronik. Detta protokoll ger ett detaljerat arbetsflöde för att demonstrera användningen av en gemensam femtosekundlaserkälla för realtid, tvåfärgad SRS-avbildning och generering av pseudo-H & E-bilder från mushjärnvävnad. Protokollet kommer att omfatta följande förfaranden:

Justering och chirp optimering
De flesta SRS-bildscheman använder antingen pikosekund- eller femtosekundlasrar som excitationskälla. Med femtosekundlasrar är laserns bandbredd mycket större än Raman-linjebredden. För att övervinna denna begränsning används en spektral fokuseringsmetod för att kvittra femtosekundlasrarna till en pikosekunds tidsskala för att uppnå smal spektral upplösning¹⁰. Optimal spektral upplösning uppnås endast när den temporala chirp (även känd som gruppfördröjningsdispersionen eller bara dispersionen) är korrekt matchad för pumpen och Stokes-lasrarna. Justeringsförfarandet och de steg som behövs för att optimera spridningen av laserstrålarna med hjälp av högdispersiva glasstavar demonstreras här.

Frekvenskalibrering
En fördel med spektralfokusering SRS är att Raman-excitationen snabbt kan ställas in genom att ändra tidsfördröjningen mellan pumpen och Stokes-lasrarna. Sådan inställning ger snabb avbildning och tillförlitligt spektralförvärv jämfört med att ställa in laservåglängder. Det linjära förhållandet mellan excitationsfrekvens och tidsfördröjning kräver emellertid extern kalibrering. Organiska lösningsmedel med kända Raman-toppar används för att kalibrera Raman-frekvensen för spektralfokusering SRS.

Tvåfärgsavbildning i realtid
Det är viktigt att öka bildhastigheten i vävnadsdiagnosapplikationer för att förkorta den tid som behövs för att analysera stora vävnadsprover. Samtidig tvåfärgad SRS-avbildning av lipider och proteiner eliminerar behovet av att ställa in lasern eller tidsfördröjningen, vilket ökar bildhastigheten med mer än två gånger. Detta uppnås genom att använda en ny ortogonal moduleringsteknik och dubbelkanalig demodulering med en inlåsningsförstärkare¹¹. Detta dokument beskriver protokollet för ortogonal modulering och tvåkanalig bildförvärv.

Epi-mode SRS-avbildning
Majoriteten av SRS-avbildning som hittills visats utförs i överföringsläge. Epi-mode-avbildning detekterar bakåtstänkta fotoner från vävnad¹². För patologiska applikationer kan kirurgiska prover vara ganska stora. För avbildning av överföringsläge är vävnadssektion ofta nödvändig, vilket oönskat kräver extra tid. Däremot kan epi-mode-avbildning fungera med intakta kirurgiska prover. Eftersom samma mål används för att samla in bakåtstiterat ljus finns det inte heller något behov av att justera en kondensor med hög numerisk bländare som krävs för överföringsavbildning. Epi-mode är också det enda alternativet när vävnadssektion är svårt, till exempel med ben. Tidigare har vi visat att för hjärnvävnad erbjuder epi-mode-avbildning överlägsen bildkvalitet för vävnadstjocklek > 2 mm¹³. Detta protokoll använder en polariserande stråldelare (PBS) för att samla spridda fotoner depolariserade av vävnad. Det är möjligt att samla fler fotoner med en ringformig detektor på bekostnad av komplexiteten hos anpassad detektormontering¹². PBS-metoden är enklare att implementera (liknande fluorescens), med standardfotodioden som redan används för detektering av överföringsläge.

Pseudo-H&E bildgenerering
När tvåfärgade SRS-bilder har samlats in kan de färgas om för att simulera H&E-färgning. Detta dokument visar proceduren för att konvertera lipid- och protein SRS-bilder till pseudo-H & E SRS-bilder för patologiska applikationer. Det experimentella protokollet beskriver kritiska steg som behövs för att generera högkvalitativa SRS-bilder. Förfarandet som visas här är inte bara tillämpligt på vävnadsdiagnos utan kan också anpassas för många andra hyperspektrala SRS-avbildningsapplikationer som läkemedelsavbildning och metabolisk avbildning^14,15.

Allmänna systemkrav
Lasersystemet för detta protokoll måste kunna mata ut 2 synkroniserade femtosekundlaserstrålar. Systemen har idealiskt en optisk parametrisk oscillator (OPO) för bred våglängdsinställning av en av laserstrålarna. Installationen i detta protokoll använder ett kommersiellt lasersystem Insight DS + som matar ut två lasrar (en fast stråle vid 1 040 nm och en OPO-baserad avstämbar stråle, från 680 till 1 300 nm) med en repetitionshastighet på 80 MHz. Laserskanningsmikroskop, antingen från stora mikroskoptillverkare eller hembyggda, kan användas för SRS-avbildning. Det använda mikroskopet är ett upprätt laserskanningsmikroskop byggt ovanpå en kommersiell upprätt mikroskopram. Ett par 5 mm galvospeglar används för att skanna laserstrålen. För användare som väljer att anta ett hembyggt laserskanningsmikroskop, se ett tidigare publicerat protokoll för konstruktion av ett laserskanningsmikroskop¹⁶.

Protocol

Alla försöksdjursförsök utfördes med 200 μm, fasta, sektionerade mushjärlor, i enlighet med protokollet (# 4395-01) godkänt av Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Washington. Vilda möss (C57BL /6J-stammen) avlivas med CO2. Därefter utförs en kraniotomi för att extrahera sina hjärnor för fixering i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning. Hjärnorna är inbäddade i en 3% agaros och 0,3% gelatinblandning och delas upp i 200 μm tjocka skivor av en vibratom….

Representative Results

Optimera spektral upplösning:Dispersion genom ett material påverkas av det dispersiva mediet (längd och material) och våglängd. Ändring av dispersionsstångens längd påverkar spektralupplösningen och signalstorleken. Det är ett ge-och-ta-förhållande som kan vägas olika beroende på ansökan. Stavarna sträcker ut strålpulsen från att vara bred i frekvens och smal i tid till att vara smal i frekvens och bred i tiden. Figur 7 visar effekten av varierande sta…

Discussion

Det tvåfärgade SRS-avbildningsschemat som presenteras i detta protokoll hänger på korrekt implementering av enfärgad SRS-avbildning. I enfärgad SRS-avbildning är de kritiska stegen rumslig inriktning, tidsmässig inriktning, moduleringsdjup och fasförskjutning. Rumslig kombination av de två strålarna åstadkoms av en dikroisk spegel. Flera styrspeglar används för finjustering när balkarna skickas till dikrospegeln. När balkarna har kombinerats med den dikroiska spegeln kan rumslig inriktning bekräftas geno…

Materials

100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.