Protokollen introducerer en metode med høj kapacitet til måling af afslapning af ikke-fotokemisk slukning ved pulsamplitudemoduleret klorofylfluoremetri. Metoden anvendes på markdyrket Glycine max og kan tilpasses andre arter for at screene for genetisk mangfoldighed eller avlspopulationer.
Fotosyntese er ikke optimeret i moderne afgrøde sorter, og giver derfor mulighed for forbedring. Fremskyndelse af lempelsen af ikke-fotokemisk slukning (NPQ) har vist sig at være en effektiv strategi til at øge fotosyntetisk ydeevne. Potentialet til at avle for forbedret NPQ og en fuldstændig forståelse af det genetiske grundlag for NPQ-afslapning mangler imidlertid på grund af begrænsninger i oversampling og dataindsamling fra markdyrkede afgrødeplanter. På baggrund af tidligere rapporter præsenterer vi et high-throughput assay til analyse af NPQ-afslapningshastigheder i Glycine max (sojabønne) ved hjælp af pulsamplitudemoduleret (PAM) klorofylfluoretri. Bladskiver udtages fra markdyrkede sojabønner inden transport til et laboratorium, hvor NPQ-afslapning måles i et lukket PAM-fluorometer. NPQ-afslapningsparametre beregnes ved at tilpasse en bi-eksponentiel funktion til de målte NPQ-værdier efter en overgang fra højt til svagt lys. Ved hjælp af denne metode er det muligt at teste hundredvis af genotyper inden for en dag. Proceduren har potentialet til at screene mutant- og mangfoldighedspaneler for variation i NPQ-afslapning og kan derfor anvendes på både grundlæggende og anvendte forskningsspørgsmål.
Fotosyntese består af lysabsorption, primær elektronoverførsel, energistabilisering og syntese og transport af fotosyntetiske produkter1. Forståelse af hvert trin er afgørende for at guide bestræbelserne på at øge beskæringsfotosyntetisk effektivitet. Lys påvirker fotosyntesehastigheden, hvilket kræver balancering af energiforsyningen i form af fotoner med efterspørgsel efter reducerende ækvivalenter. Når udbuddet overstiger efterspørgslen, f.eks. under højlys eller under reduceret CO2 -fiksering forårsaget af stomatal lukning, øger opbygning af reducerende effekt sandsynligheden for reaktiv iltartdannelse med potentiale til at beskadige det fotosyntetiske apparat og forringe elektrontransporten. For at forhindre skade har planter derfor udviklet flere fotobeskyttende mekanismer, herunder afgiftning af reaktive iltarter og ikke-fotokemisk slukning af de ophidsede klorofyltilstande (NPQ)2.
Opretholdelse af høje fotosyntesehastigheder er udfordrende under et feltmiljø. Sæsonmæssige og daglige ændringer sammen med miljømæssige udsving såsom vindinducerede bladbevægelser og forbigående skydække forårsager skift i mængden og intensiteten af lys, der modtages af planter til fotosyntese3. NPQ spreder overskydende lysenergi og kan hjælpe med at forhindre fotoskader, samtidig med at der gives mulighed for vedvarende fotosyntesehastigheder ved højlys4. Imidlertid fortsætter langvarig NPQ under overgange i højt til svagt lys med at sprede energi, der kan bruges til kulstofreduktion5. Som følge heraf kan fremskyndelse af lempelsen af NPQ øge effektiviteten af fotosyntese6, hvilket gør NPQ-afslapning til et attraktivt mål for afgrødeforbedring.
Pulsamplitudemoduleret klorofylfluorescensanalyse (PAM) kan bruges til at beregne NPQ ud fra målbare parametre (supplerende tabel 1 og supplerende tabel 2)7,8,9. Denne artikel fokuserer på at bestemme NPQ-afslapningshastigheder i markdyrkede planter med det formål at screene naturlig variation i germplasm. Imidlertid kan PAM klorofylfluorometrianalyse også anvendes til en lang række formål, anvendes på arter lige fra alger til højere planter og gennemgås andetsteds 7,8,9.
I et mørkt tilpasset blad eller celle er fotosystem II (PSII) reaktionscentre åbne for at modtage elektroner, og der er ingen NPQ. Tænding af et lavintensitetsmålingslys fremkalder klorofylfluorescens, samtidig med at elektrontransport gennem PSII undgås. Den registrerede mindste fluorescens i denne mørktilpassede tilstand er beskrevet med parameteren Fo. Anvendelse af en højintensiv lyspuls på et mørkt tilpasset blad kan hurtigt reducere den første stabile elektronacceptorpulje af quinoner bundet til quinon A-stedet. Dette blokerer midlertidigt elektronoverførselskapacitet i PSII-reaktionscentre, som derefter siges at være lukkede og ude af stand til at modtage elektroner fra vandopdeling. Ved at bruge en kort pulsvarighed er der utilstrækkelig tid til at stimulere NPQ. Den resulterende klorofylfluorescens svarer til den maksimale værdi, der kan opnås i fravær af NPQ eller maksimal fluorescens, Fm. Forskellen mellem minimal og maksimal fluorescens kaldes variabel fluorescens, Fv. Det maksimale fotokemiske kvanteudbytte af fotosystem II (Fv/Fm) beregnes ud fra disse to parametre ved hjælp af følgende ligning:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Dette kan give en vigtig indikator for fotosystemfunktion og stress. Tænding af et aktinisk (fotosyntetisk) lys stimulerer ikke-fotokemisk slukning, og efterfølgende påføring af en mættende blitz muliggør måling af lystilpasset maksimal fluorescens, Fm ‘. Ved at sammenligne forskellen mellem mørk og lystilpasset maksimal fluorescens kan NPQ beregnes i henhold til Stern-Volmer ligningen10:
NPQ = Fm/Fm‘ – 1
I højere anlæg er NPQ blevet beskrevet som bestående af mindst fem forskellige komponenter, herunder qE, qT, qZ, qI og qH. De præcise mekanismer, der er involveret i NPQ, er ikke fuldt ud forstået; qE anses dog for at være hovedkomponenten i NPQ i de fleste anlæg. Afgørende faktorer for fuld engagement af qE har vist sig at omfatte opbygningen af en protongradient over thylakoidmembranen, aktiviteten af fotosystem II underenhed S11,12 og de-epoxiderede xanthophylls, antheraxanthin, lutein og især zeaxanthin13. qE slapper hurtigst af enhver NPQ-komponent (< 2 min)14, og reversibel aktivering af qE er derfor særlig vigtig for tilpasning til skiftende lysintensiteter. En anden langsommere fase af NPQ-afslapning (~ 2-30 min) omfatter både qT, relateret til tilstandsovergange, og qZ, der involverer interkonvertering af zeaxanthin til violaxanthin15. Langsom afslappende (> 30 min) NPQ kan omfatte både fotoinhibitory quenching (qI)16 og processer uafhængigt af fotoskade17,18, såsom qH, som er vedvarende slukning i de perifere antenner af PSII medieret af et plastid lipocalinprotein19,20.
NPQ øges under eksponering for højt lys. Efterfølgende overførsel til svagt lys kan resultere i nedregulering af NPQ. Henfaldet af hurtige, mellemliggende og langsomme afslappende faser kan fanges i parametrene for en bi-eksponentiel funktion 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Det teoretiske grundlag for den bi-eksponentielle funktion er baseret på antagelsen om førsteordensudnyttelse af hypotetiske slukningsmidler, herunder qE (Aq1), den kombinerede afslapning af qZ og qT (Aq2) med de tilsvarende tidskonstanter τq1 og τq2 og langsigtet NPQ, som omfatter qI og fotoskadeuafhængige processer (Aq3). Som sådan giver den bi-eksponentielle funktion en mere realistisk repræsentation af de mange forbundne biologiske processer, der er involveret i at slukke klorofylfluorescens sammenlignet med en enklere Hill-ligning, der mangler et teoretisk grundlag24.
NPQ kan måles ved hjælp af en række kommercielt tilgængelige PAM-fluorometre25,26, fra enkle håndholdte enheder27 til mere avancerede lukkede systemer28. En begrænsning af flere af disse tilgange er imidlertid en relativt lav gennemstrømning, hvilket gør screening af store samlinger af planter udfordrende uden flere enheder og et team af forskere. For at løse dette problem udviklede McAusland et al. en procedure baseret på udskåret bladvæv og brugte den til at identificere forskelle i klorofylfluorescens mellem to hvedesorter29. Tiltrækningen ved denne tilgang er, at billeddannelse af bladskiver, taget fra flere planter med en enkelt enhed, kan lette screening af hundredvis af genotyper inden for en dag. Dette gør det muligt at vurdere variation i NPQ-afslapning som en del af genom brede associeringsundersøgelser eller til screening af avlspopulationer med potentiale til at øge afgrødens fotosyntetiske effektivitet og i sidste ende udbytte.
På baggrund af resultaterne fra McAusland et al.29 bruger vi PAM klorofylfluorescensanalyse af bladskiver til screening med høj kapacitet af NPQ-afslapningshastigheder i Glycine max (G.max; sojabønne). Denne protokol bruger CF Imager25, som kan sammenlignes med andre kommercielt tilgængelige lukkede PAM-systemer, såsom den populære FluorCam26. Med et mørkt rum til tilpasning af prøver kan brugerne afbilde 96-brøndplader, petriskåle og små planter. Den vigtigste fordel ved denne tilgang er stigningen i gennemstrømning ved at bruge bladskiver sammenlignet med sekventiel analyse af individuelle planter. Heri præsenterer vi repræsentative resultater og en metode til prøveudtagning, måling og analyse af NPQ i markdyrkede planter.
Omhyggelig valg og håndtering af bladskiver er afgørende for at opnå pålidelige målinger af NPQ. For det første vil skader på vævet, såsom grov håndtering med pincet, medføre stress, hvilket resulterer i lave værdier for den maksimale kvanteeffektivitet af fotosyntese. Ikke-stressede planter har typisk Fv/Fm-værdier på omkring 0,8318, med betydelige fald, der indikerer en reduktion i fotosyntetisk ydeevne9. Planter dyrke…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af forskningsprojektet Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE), der er finansieret af Bill &Melinda Gates Foundation, Foundation for Food and Agriculture Research og U.K. Foreign, Commonwealth &Development Office under tilskudsnummer OPP1172157.
24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |