Vi udviklede et intronisk mikroRNA biogenese reporterassay til brug i celler in vitro med fire plasmider: en med intronisk miRNA, en med målet, en til at overudtrykke et regulatorisk protein og en til Renilla luciferase. MiRNA’et blev behandlet og kunne kontrollere luciferaseekspression ved at binde til målsekvensen.
MicroRNA’er (miRNA’er) er korte RNA-molekyler, der er udbredt i eukaryoter. De fleste miRNA’er transskriberes fra introner, og deres modning involverer forskellige RNA-bindende proteiner i kernen. Modne miRNA’er formidler ofte genhæmning, og dette er blevet et vigtigt redskab til at forstå post-transkriptionelle begivenheder. Derudover kan det udforskes som en lovende metode til genterapier. Der mangler imidlertid i øjeblikket direkte metoder til vurdering af miRNA-ekspression i pattedyrcellekulturer. Her beskriver vi en effektiv og enkel metode, der hjælper med at bestemme miRNA-biogenese og modning gennem bekræftelse af dets interaktion med målsekvenser. Dette system tillader også adskillelse af eksogen miRNA-modning fra dets endogene aktivitet ved anvendelse af en doxycyclin-inducerbar promotor, der er i stand til at kontrollere primær miRNA (pri-miRNA) transkription med høj effektivitet og lave omkostninger. Dette værktøj tillader også modulering med RNA-bindende proteiner i et separat plasmid. Ud over dets anvendelse med en række forskellige miRNA’er og deres respektive mål kan det tilpasses forskellige cellelinjer, forudsat at disse er modtagelige for transfektion.
Forløber mRNA-splejsning er en vigtig proces til regulering af genekspression i eukaryoter1. Fjernelsen af introns og foreningen af exoner i modent RNA katalyseres af splejseosomet, et 2 megadalton ribonukleoproteinkompleks sammensat af 5 snRNA’er (U1, U2, U4, U5 og U6) sammen med mere end 100 proteiner 2,3. Splejsningsreaktionen forekommer co-transkriptionelt, og splejseosomet samles ved hver ny intron styret af genkendelse af konserverede splejsningssteder ved exon-intron-grænser og inden for intron4. Forskellige introns kan have forskellige splejsningshastigheder på trods af den bemærkelsesværdige bevarelse af splejsningskomplekset og dets komponenter. Ud over forskellene i bevarelse af splejsningssteder kan regulatoriske sekvenser fordelt på introns og exoner guide RNA-bindende proteiner (RBP) og stimulere eller undertrykke splejsning 5,6. HuR er en allestedsnærværende udtrykt RBP og er en vigtig faktor for at kontrollere mRNA-stabilitet7. Tidligere resultater fra vores gruppe viste, at HuR kan binde til introner indeholdende miRNA’er, hvilket indikerer, at dette protein kan være en vigtig faktor for at lette miRNA-behandling og modning, hvilket også fører til generering af alternative splejsningsisoformer 6,8,9.
Mange mikroRNA’er (miRNA’er) er kodet fra introniske sekvenser. Mens nogle er en del af intronen, er andre kendt som “mirtrons” og er dannet af hele intron 10,11. miRNA’er er korte ikke-kodende RNA’er, der spænder fra 18 til 24 nukleotider i længden12. Deres modne sekvens viser delvis eller total komplementaritet med målsekvenser i mRNA’er, hvilket påvirker translation og / eller mRNA-henfaldshastigheder. Kombinationerne af miRNA’er og mål driver cellen til forskellige resultater. Flere miRNA’er kan drive celler til pro- eller antitumorfænotyper13. Onkogene miRNA’er er normalt målrettet mod mRNA’er, der udløser en undertrykkende egenskab, hvilket fører til øget cellulær proliferation, migration og invasion14. På den anden side kan tumorundertrykkende miRNA’er målrette onkogene mRNA’er eller mRNA’er relateret til øget celleproliferation.
Forarbejdning og modning af miRNA’er er også afhængige af deres oprindelse. De fleste introniske miRNA’er behandles med deltagelse af mikroprocessoren, dannet af ribonuklease Drosha og proteinkofaktorer12. Mirtroner behandles med aktiviteten af splejseosomet uafhængigt af Drosha15. I betragtning af den høje frekvens af miRNA’er, der findes i introns, antog vi, at RNA-bindende proteiner involveret i splejsning også kunne lette behandlingen og modningen af disse miRNA’er. Især RBP hnRNP A2 / B1 har allerede været forbundet med mikroprocessoren og miRNA-biogenese16.
Vi har tidligere rapporteret, at flere RNA-bindende proteiner, såsom hnRNP’er og HuR, er forbundet med introniske miRNA’er ved massespektrometri17. HuR’s (ELAVL1) tilknytning til miRNA’er fra miR-17-92 intronisk klynge blev bekræftet ved anvendelse af immunoprecipitation og i silicoanalyse 9. miR-17-92 er en intronisk miRNA-klynge sammensat af seks miRNA’er med øget ekspression i forskellige kræftformer 18,19. Denne klynge er også kendt som “oncomiR-1” og består af miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b og miR-92a. miR-19a og miR-19b er blandt de mest onkogene miRNA’er i denne klynge19. Den øgede ekspression af HuR stimulerer miR-19a og miR-19b syntese9. Da introniske regioner, der flankerer denne klynge, er forbundet med HuR, udviklede vi en metode til at undersøge, om dette protein kunne regulere miR-19a og miR-19b ekspression og modning. En vigtig forudsigelse af vores hypotese var, at HuR som et regulatorisk protein kunne lette miRNA-biogenese, hvilket førte til fænotypiske ændringer. En mulighed var, at miRNA’er blev behandlet ved stimulering af HuR, men ikke ville være modne og funktionelle, og derfor ville virkningerne af proteinet ikke direkte påvirke fænotypen. Derfor udviklede vi et splejsningsreporterassay for at undersøge, om en RBP som HuR kunne påvirke biogenesen og modningen af et intronisk miRNA. Ved at bekræfte miRNA-behandling og modning viser vores assay interaktionen med målsekvensen og dannelsen af et modent og funktionelt miRNA. I vores assay kobler vi ekspressionen af en intronisk miRNA-klynge med et luciferaseplasmid for at kontrollere, om miRNA-målbinding i dyrkede celler.
Præ-mRNA-splejsning er en vigtig proces til regulering af genekspression, og dens kontrol kan udløse stærke virkninger på cellefænotypiske modifikationer22,23. Mere end 70% af miRNA’er transskriberes fra introner hos mennesker, og vi antog, at deres behandling og modning kunne lettes ved at splejse regulatoriske proteiner 24,25. Vi udviklede en metode til at analysere intronisk miRNA-behandling og fu…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) for HeLa-Cre-cellerne og pRD-RIPE og pCAGGS-Cre plasmider. Vi takker Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes og Anselmo Moriscot for deres støtte.
Recombinant DNA | |||
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
Antibodies | |||
anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
Experimental Models: Cell Lines | |||
HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
Chemicals and Peptides | |||
DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
L-glutamine | Life Technologies | ||
Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
pGEM-T | Promega | A3600 | |
Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
XhoI | Promega | R616A | |
Oligonucleotides | |||
forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
Software and Algorithms | |||
Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |