Репортерский анализ для анализа созревания интронной микроРНК в клетках млекопитающих
Summary
Мы разработали интронный анализ биогенеза микроРНК, который будет использоваться в клетках in vitro с четырьмя плазмидами: одна с интронной миРНК, одна с мишенью, одна для сверхэкспрессии регуляторного белка и одна для люциферазы Renilla. МиРНК была обработана и могла контролировать экспрессию люциферазы путем связывания с целевой последовательностью.
Abstract
МикроРНК (миРНК) представляют собой короткие молекулы РНК, которые широко распространены у эукариот. Большинство миРНК транскрибируются из интронов, и их созревание включает в себя различные РНК-связывающие белки в ядре. Зрелые микроРНК часто опосредуют глушение генов, и это стало важным инструментом для понимания посттранскрипционных событий. Кроме того, его можно исследовать как перспективную методологию генной терапии. Однако в настоящее время отсутствуют прямые методы оценки экспрессии миРНК в культурах клеток млекопитающих. Здесь мы описываем эффективный и простой метод, который помогает в определении биогенеза и созревания миРНК путем подтверждения ее взаимодействия с целевыми последовательностями. Кроме того, эта система позволяет отделить созревание экзогенной миРНК от ее эндогенной активности с помощью доксициклин-индуцируемого промотора, способного контролировать транскрипцию первичной миРНК (примиРНК) с высокой эффективностью и низкой стоимостью. Этот инструмент также позволяет модулировать РНК-связывающими белками в отдельной плазмиде. В дополнение к его использованию с различными миРНК и их соответствующими мишенями, он может быть адаптирован к различным клеточным линиям, при условии, что они поддаются трансфекции.
Introduction
Сплайсинг мРНК-предшественников является важным процессом регуляции экспрессии генов у эукариот1. Удаление интронов и объединение экзонов в зрелой РНК катализируется сплайсеосомой, 2-мегадальтонным рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 и U6) вместе с более чем 100 белками 2,3. Реакция сплайсинга происходит совместно транскрипционно, и сплайсеосома собирается на каждом новом интроне, руководствуясь распознаванием законсервированных участков сращивания на границах экзон-интрона и внутри интрона4. Различные интроны могут иметь разную скорость сплайсинга, несмотря на замечательное сохранение комплекса сплайсеосом и его компонентов. В дополнение к различиям в сохранении места сращивания, регуляторные последовательности, распределенные на интронах и экзонах, могут направлять РНК-связывающие белки (RBP) и стимулировать или подавлять сплайсинг 5,6. HuR является повсеместно экспрессируемым RBP и является важным фактором для контроля стабильности мРНК7. Предыдущие результаты нашей группы показали, что HuR может связываться с интронами, содержащими миРНК, что указывает на то, что этот белок может быть важным фактором для облегчения обработки и созревания миРНК, что также приводит к генерации альтернативных изоформ сплайсинга 6,8,9.
Многие микроРНК (миРНК) кодируются из интронных последовательностей. В то время как некоторые из них являются частью интрона, другие известны как «миртроны» и образованы целым интроном10,11. миРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, в диапазоне от 18 до 24 нуклеотидов длиной12. Их зрелая последовательность демонстрирует частичную или полную комплементарность с целевыми последовательностями в мРНК, что влияет на скорость трансляции и/или распада мРНК. Комбинации миРНК и мишеней приводят клетку к различным результатам. Несколько микроРНК могут приводить клетки к про- или противоопухолевым фенотипам13. Онкогенные миРНК обычно нацелены на мРНК, которые вызывают супрессивную характеристику, что приводит к увеличению клеточной пролиферации, миграции и инвазии14. С другой стороны, опухолеподавляющие миРНК могут быть нацелены на онкогенные мРНК или мРНК, связанные с повышенной пролиферацией клеток.
Обработка и созревание миРНК также зависят от их происхождения. Большинство интронных миРНК обрабатываются с участием микропроцессора, образованного рибонуклеазой дрошей и белковыми кофакторами12. Миртроны обрабатываются активностью сплайсеосомы независимо от Drosha15. Учитывая высокую частоту миРНК, обнаруженных в интронах, мы предположили, что РНК-связывающие белки, участвующие в сплайсинге, также могут способствовать обработке и созреванию этих миРНК. Примечательно, что RBP hnRNP A2/B1 уже ассоциируется с микропроцессором и биогенезом миРНК16.
Ранее мы сообщали, что несколько РНК-связывающих белков, таких как hnRNP и HuR, связаны с интронными миРНК с помощью масс-спектрометрии17. Связь HuR (ELAVL1) с миРНК из интронного кластера miR-17-92 была подтверждена с использованием иммунопреципитации и анализа in silico 9. miR-17-92 представляет собой интронный кластер миРНК, состоящий из шести миРНК с повышенной экспрессией при различных видах рака18,19. Этот кластер также известен как «oncomiR-1» и состоит из miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b и miR-92a. miR-19a и miR-19b являются одними из самых онкогенных миРНК этого кластера19. Повышенная экспрессия HuR стимулирует синтез miR-19a и miR-19b 9. Поскольку интронные области, фланкирующие этот кластер, связаны с HuR, мы разработали метод исследования того, может ли этот белок регулировать экспрессию и созревание miR-19a и miR-19b. Одним из важных предсказаний нашей гипотезы было то, что в качестве регуляторного белка HuR может способствовать биогенезу миРНК, что приводит к фенотипическим изменениям. Одна из возможностей заключалась в том, что миРНК были обработаны стимуляцией HuR, но не были зрелыми и функциональными, и, следовательно, эффекты белка не влияли непосредственно на фенотип. Поэтому мы разработали сращивающий репортерный анализ, чтобы выяснить, может ли RBP, такой как HuR, влиять на биогенез и созревание интронной миРНК. Подтверждая обработку и созревание миРНК, наш анализ показывает взаимодействие с целевой последовательностью и генерацию зрелой и функциональной миРНК. В нашем анализе мы соединяем экспрессию интронного кластера миРНК с плазмидой люциферазы, чтобы проверить связывание миРНК-мишеней в культивируемых клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сплайсинг пре-мРНК является важным процессом для регуляции экспрессии генов, и его контроль может вызвать сильное воздействие на фенотипические модификации клеток22,23. Более 70% микроРНК транскрибируются из интронов у людей, и мы предположили, что их обра?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Е. Макееву (Наньянский технологический университет, Сингапур) за клетки HeLa-Cre и плазмиды pRD-RIPE и pCAGGS-Cre. Мы благодарим Эдну Кимуру, Каролину Перселл Гоус, Гизелу Рамос, Люсию Россетти Лопес и Ансельмо Морискота за их поддержку.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
- Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
- Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
- Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
- Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
- Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
- Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
- Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
- Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
- Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
- Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
- Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
- Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
- Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Recherche en cancérologie. 76 (6), 1549-1559 (2016).
- Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
- Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).
