Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos
Summary
Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.
Abstract
Los microARN (miARN) son moléculas cortas de ARN que están muy extendidas en eucariotas. La mayoría de los miARN se transcriben a partir de intrones, y su maduración involucra diferentes proteínas de unión al ARN en el núcleo. Los miARN maduros con frecuencia median el silenciamiento génico, y esto se ha convertido en una herramienta importante para comprender los eventos post-transcripcionales. Además de eso, se puede explorar como una metodología prometedora para las terapias génicas. Sin embargo, actualmente hay una falta de métodos directos para evaluar la expresión de miRNA en cultivos celulares de mamíferos. Aquí, describimos un método eficiente y simple que ayuda a determinar la biogénesis y maduración de miRNA a través de la confirmación de su interacción con secuencias objetivo. Además, este sistema permite separar la maduración exógena de miRNA de su actividad endógena utilizando un promotor inducible por doxiciclina capaz de controlar la transcripción de miRNA primario (pri-miRNA) con alta eficiencia y bajo costo. Esta herramienta también permite la modulación con proteínas de unión a ARN en un plásmido separado. Además de su uso con una variedad de miRNAs diferentes y sus respectivas dianas, se puede adaptar a diferentes líneas celulares, siempre que sean susceptibles de transfección.
Introduction
El empalme de ARNm precursor es un proceso importante para la regulación de la expresión génica en eucariotas1. La eliminación de intrones y la unión de exones en ARN maduro es catalizada por el espliceosoma, un complejo ribonucleoproteico de 2 megadaltones compuesto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) junto con más de 100 proteínas 2,3. La reacción de empalme ocurre co-transcripcionalmente, y el espliceosoma se ensambla en cada nuevo intrón guiado por el reconocimiento de los sitios de empalme conservados en los límites exón-intrón y dentro del intrón4. Diferentes intrones pueden tener diferentes velocidades de empalme a pesar de la notable conservación del complejo de espliceosoma y sus componentes. Además de las diferencias en la conservación del sitio de empalme, las secuencias reguladoras distribuidas en intrones y exones pueden guiar las proteínas de unión al ARN (RBP) y estimular o reprimir el empalme 5,6. HuR es una RBP expresada ubicuamente y es un factor importante para controlar la estabilidad del ARNm7. Resultados previos de nuestro grupo mostraron que HuR puede unirse a intrones que contienen miRNAs, lo que indica que esta proteína podría ser un factor importante para facilitar el procesamiento y la maduración de miRNA, lo que también conduce a la generación de isoformas de empalme alternativas 6,8,9.
Muchos microARN (miARN) se codifican a partir de secuencias intrónicas. Mientras que algunos son parte del intrón, otros se conocen como “mirtrones” y están formados por todo el intrón10,11. Los miRNAs son ARN cortos no codificantes, que van de 18 a 24 nucleótidos de longitud12. Su secuencia madura muestra complementariedad parcial o total con las secuencias diana en los ARNm, lo que afecta a las tasas de traducción y/o decaimiento del ARNm. Las combinaciones de miARN y dianas conducen a la célula a diferentes resultados. Varios miRNAs pueden conducir células a fenotipos pro o antitumorales13. Los miARN oncogénicos generalmente se dirigen a ARNm que desencadenan una característica supresora que conduce a un aumento de la proliferación, migración e invasión celular14. Por otro lado, los miARN supresores de tumores podrían dirigirse a ARNm oncogénicos o ARNm relacionados con el aumento de la proliferación celular.
El procesamiento y la maduración de los miRNAs también dependen de su origen. La mayoría de los miRNAs intrónicos son procesados con la participación del microprocesador, formado por la ribonucleasa Drosha y los cofactores proteicos12. Los mirtrones se procesan con la actividad del espliceosoma independientemente de Drosha15. Teniendo en cuenta la alta frecuencia de miARN que se encuentran dentro de los intrones, planteamos la hipótesis de que las proteínas de unión al ARN involucradas con el empalme también podrían facilitar el procesamiento y la maduración de estos miARN. En particular, el RBP hnRNP A2/B1 ya se ha asociado con el microprocesador y la biogénesis del miARN16.
Hemos informado previamente que varias proteínas de unión a ARN, como hnRNPs y HuR, están asociadas con miRNAs intrónicos por espectrometría de masas17. La asociación de HuR (ELAVL1) con miRNAs del cluster intrónico miR-17-92 fue confirmada mediante inmunoprecipitación y análisis in silico 9. miR-17-92 es un grupo de miARN intrónico compuesto por seis miARN con mayor expresión en diferentes cánceres18,19. Este grupo también se conoce como “oncomiR-1” y está compuesto por miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b y miR-92 a. miR-19 a y miR-19b se encuentran entre los miRNAs más oncogénicos de este grupo 19. El aumento de la expresión de HuR estimula la síntesis de miR-19a y miR-19b 9. Dado que las regiones intrónicas que flanquean este grupo están asociadas con HuR, desarrollamos un método para investigar si esta proteína podría regular la expresión y maduración de miR-19a y miR-19b. Una predicción importante de nuestra hipótesis fue que, como proteína reguladora, HuR podría facilitar la biogénesis de miRNA, dando lugar a alteraciones fenotípicas. Una posibilidad era que los miRNAs fueran procesados por la estimulación de HuR pero no fueran maduros y funcionales y, por lo tanto, los efectos de la proteína no impactaran directamente en el fenotipo. Por lo tanto, desarrollamos un ensayo de splicing reporter para investigar si un RBP como HuR podría afectar la biogénesis y la maduración de un miRNA intrónico. Al confirmar el procesamiento y la maduración del miARN, nuestro ensayo muestra la interacción con la secuencia objetivo y la generación de un miARN maduro y funcional. En nuestro ensayo, acoplamos la expresión de un grupo de miARN intrónico con un plásmido luciferasa para verificar la unión al objetivo de miARN en células cultivadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El empalme de pre-ARNm es un proceso importante para la regulación de la expresión génica, y su control puede desencadenar fuertes efectos sobre las modificaciones fenotípicas celulares22,23. Más del 70% de los miRNAs se transcriben a partir de intrones en humanos, y planteamos la hipótesis de que su procesamiento y maduración podrían facilitarse mediante el empalme de proteínas reguladoras24,25….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a E. Makeyev (Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur) por las células HeLa-Cre y los plásmidos pRD-RIPE y pCAGGS-Cre. Agradecemos a Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes y Anselmo Moriscot por su apoyo.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
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| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
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| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
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| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
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| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
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| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
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| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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