Vi utvecklade en intronic microRNA biogenesis reporter assay som ska användas i celler in vitro med fyra plasmider: en med intronic miRNA, en med målet, en för att överuttrycka ett reglerande protein och en för Renilla luciferas. MiRNA bearbetades och kunde kontrollera luciferasuttryck genom att binda till målsekvensen.
MikroRNA (miRNA) är korta RNA-molekyler som är utbredda i eukaryoter. De flesta miRNA transkriberas från introner, och deras mognad involverar olika RNA-bindande proteiner i kärnan. Mogna miRNA förmedlar ofta gendämpning, och detta har blivit ett viktigt verktyg för att förstå post-transkriptionella händelser. Förutom det kan det utforskas som en lovande metod för genterapier. Det saknas dock för närvarande direkta metoder för att bedöma miRNA-uttryck i däggdjurscellkulturer. Här beskriver vi en effektiv och enkel metod som hjälper till att bestämma miRNA-biogenes och mognad genom bekräftelse av dess interaktion med målsekvenser. Detta system möjliggör också separation av exogen miRNA-mognad från dess endogena aktivitet med användning av en doxycyklininducerbar promotor som kan styra primär miRNA (pri-miRNA) transkription med hög effektivitet och låg kostnad. Detta verktyg möjliggör också modulering med RNA-bindande proteiner i en separat plasmid. Förutom dess användning med en mängd olika miRNA och deras respektive mål kan den anpassas till olika cellinjer, förutsatt att dessa är mottagliga för transfektion.
Prekursor-mRNA-splitsning är en viktig process för reglering av genuttryck i eukaryoter1. Avlägsnandet av introner och föreningen av exoner i moget RNA katalyseras av spliceosomen, ett 2 megadalton ribonukleoproteinkomplex bestående av 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 och U6) tillsammans med mer än 100 proteiner 2,3. Skarvningsreaktionen sker co-transkriptionellt, och skarven monteras vid varje ny intron som styrs av igenkänningen av bevarade skarvställen vid exon-introngränser och inom intron4. Olika introner kan ha olika skarvningshastigheter trots det anmärkningsvärda bevarandet av skarvkomplexet och dess komponenter. Förutom skillnaderna i bevarande av skarvplatser kan regleringssekvenser fördelade på introner och exoner styra RNA-bindande proteiner (RBP) och stimulera eller undertrycka skarvning 5,6. HuR är en allestädes närvarande uttryckt RBP och är en viktig faktor för att kontrollera mRNA-stabilitet7. Tidigare resultat från vår grupp visade att HuR kan binda till introner som innehåller miRNA, vilket indikerar att detta protein kan vara en viktig faktor för att underlätta miRNA-bearbetning och mognad, vilket också leder till generering av alternativa skarvningsisoformer 6,8,9.
Många mikroRNA (miRNA) kodas från introniska sekvenser. Medan vissa är en del av intronen, är andra kända som “mirtroner” och bildas av hela intron10,11. miRNA är korta icke-kodande RNA, som sträcker sig från 18 till 24 nukleotider i längd12. Deras mogna sekvens visar partiell eller total komplementaritet med målsekvenser i mRNA, vilket påverkar translations- och / eller mRNA-sönderfallshastigheter. Kombinationerna av miRNA och mål driver cellen till olika resultat. Flera miRNA kan driva celler till pro- eller antitumörfenotyper13. Onkogena miRNA riktar sig vanligtvis mot mRNA som utlöser en undertryckande egenskap, vilket leder till ökad cellulär spridning, migration och invasion14. Å andra sidan kan tumörsuppressiva miRNA rikta in sig på onkogena mRNA eller mRNA relaterade till ökad cellproliferation.
Bearbetningen och mognaden av miRNA är också beroende av deras ursprung. De flesta introniska miRNA bearbetas med deltagande av mikroprocessorn, bildad av ribonukleas Drosha och proteinkofaktorer12. Mirtroner bearbetas med spliceosomens aktivitet oberoende av Drosha15. Med tanke på den höga frekvensen av miRNA som finns inom introner, antog vi att RNA-bindande proteiner som är involverade i skarvning också kan underlätta bearbetningen och mognaden av dessa miRNA. I synnerhet har RBP hnRNP A2 / B1 redan associerats med mikroprocessorn och miRNA-biogenesen16.
Vi har tidigare rapporterat att flera RNA-bindande proteiner, såsom hnRNP och HuR, är associerade med introniska miRNA genom masspektrometri17. HuR:s (ELAVL1) samband med miRNA från miR-17-92 intronic-klustret bekräftades med hjälp av immunoprecipitation och in silico-analys 9. miR-17-92 är ett introniskt miRNA-kluster som består av sex miRNA med ökat uttryck i olika cancerformer18,19. Detta kluster är också känt som “oncomiR-1” och består av miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b och miR-92 a. miR-19 a och miR-19b är bland de mest onkogena miRNA i detta kluster 19. Det ökade uttrycket av HuR stimulerar miR-19a och miR-19b syntes9. Eftersom introniska regioner som flankerar detta kluster är associerade med HuR, utvecklade vi en metod för att undersöka om detta protein kunde reglera miR-19a och miR-19b uttryck och mognad. En viktig förutsägelse av vår hypotes var att HuR, som ett reglerande protein, kunde underlätta miRNA-biogenes, vilket ledde till fenotypiska förändringar. En möjlighet var att miRNA bearbetades genom stimulering av HuR men inte skulle vara mogna och funktionella och därför skulle effekterna av proteinet inte direkt påverka fenotypen. Därför utvecklade vi en skarvningsreporteranalys för att undersöka om en RBP som HuR kunde påverka biogenesen och mognaden av ett intronic miRNA. Genom att bekräfta miRNA-bearbetning och mognad visar vår analys interaktionen med målsekvensen och genereringen av ett moget och funktionellt miRNA. I vår analys kopplar vi ihop uttrycket av ett introniskt miRNA-kluster med en luciferasplasmid för att kontrollera miRNA-målbindning i odlade celler.
Pre-mRNA-skarvning är en viktig process för reglering av genuttryck, och dess kontroll kan utlösa starka effekter på cellfenotypiska modifieringar22,23. Mer än 70% av miRNA transkriberas från introner hos människor, och vi antog att deras bearbetning och mognad skulle kunna underlättas genom skarvning av reglerande proteiner24,25. Vi utvecklade en metod för att analysera intronisk miRNA-bearbetni…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma mot E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) för HeLa-Cre-cellerna och pRD-RIPE och pCAGGS-Cre plasmider. Vi tackar Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes och Anselmo Moriscot för deras stöd.
Recombinant DNA | |||
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
Antibodies | |||
anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
Experimental Models: Cell Lines | |||
HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
Chemicals and Peptides | |||
DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
L-glutamine | Life Technologies | ||
Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
pGEM-T | Promega | A3600 | |
Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
XhoI | Promega | R616A | |
Oligonucleotides | |||
forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
Software and Algorithms | |||
Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |