Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi
Summary
Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.
Abstract
MikroRNA’lar (miRNA’lar) ökaryotlarda yaygın olan kısa RNA molekülleridir. Çoğu miRNA intronlardan kopyalanır ve olgunlaşmaları çekirdekte farklı RNA bağlayıcı proteinleri içerir. Olgun miRNA’lar sıklıkla gen susturmaya aracılık eder ve bu, transkripsiyon sonrası olayları anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Bunun yanı sıra, gen terapileri için umut verici bir metodoloji olarak araştırılabilir. Bununla birlikte, şu anda memeli hücre kültürlerinde miRNA ekspresyonunu değerlendirmek için doğrudan yöntemlerin eksikliği vardır. Burada, miRNA biyogenezinin ve olgunlaşmanın belirlenmesinde, hedef dizilerle etkileşiminin doğrulanması yoluyla yardımcı olan etkili ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bu sistem, birincil miRNA (pri-miRNA) transkripsiyonunu yüksek verimlilik ve düşük maliyetle kontrol edebilen bir doksisiklin ile indüklenebilir promotör kullanarak eksojen miRNA olgunlaşmasının endojen aktivitesinden ayrılmasını sağlar. Bu araç aynı zamanda ayrı bir plazmidde RNA bağlayıcı proteinlerle modülasyona izin verir. Çeşitli farklı miRNA’lar ve bunların ilgili hedefleriyle kullanımına ek olarak, transfeksiyona uygun olmaları koşuluyla farklı hücre hatlarına uyarlanabilir.
Introduction
Prekürsör mRNA ekleme, ökaryotlarda gen ekspresyonu regülasyonu için önemli bir süreçtir1. İntronların çıkarılması ve olgun RNA’daki ekzonların birleşmesi, 5 snRNA’dan (U1, U2, U4, U5 ve U6) oluşan 2 megadalton ribonükleoprotein kompleksi olan splisozom ve 100’den fazla protein 2,3 tarafından katalize edilir. Ekleme reaksiyonu ko-transkripsiyonel olarak gerçekleşir ve splisozom, ekzon-intron sınırlarında ve intron4 içinde korunmuş ekleme bölgelerinin tanınmasıyla yönlendirilen her yeni intronda birleştirilir. Farklı intronlar, splisozom kompleksinin ve bileşenlerinin dikkate değer korunumuna rağmen farklı ekleme oranlarına sahip olabilir. Ekleme bölgesi korunumundaki farklılıklara ek olarak, intronlar ve ekzonlar üzerine dağıtılan düzenleyici diziler, RNA bağlayıcı proteinleri (RBP) yönlendirebilir ve ekleme 5,6’yı uyarabilir veya bastırabilir. HuR, her yerde eksprese edilen bir RBP’dir ve mRNA stabilitesini kontrol etmek için önemli bir faktördür7. Grubumuzdan elde edilen önceki sonuçlar, HuR’nin miRNA’lar içeren intronlara bağlanabildiğini gösterdi, bu da bu proteinin miRNA işlemesini ve olgunlaşmasını kolaylaştırmak için önemli bir faktör olabileceğini ve ayrıca alternatif ekleme izoformlarının 6,8,9 oluşumuna yol açabileceğini gösterdi.
Birçok mikroRNA (miRNA) intronik dizilerden kodlanır. Bazıları intron’un bir parçası iken, diğerleri “mirtronlar” olarak bilinir ve tüm intron10,11 tarafından oluşturulur. miRNA’lar, uzunluğu12 olan 18 ila 24 nükleotid arasında değişen kısa kodlamayan RNA’lardır. Olgun dizileri, mRNA’lardaki hedef dizilerle kısmi veya tam tamamlayıcılık gösterir, bu nedenle translasyon ve / veya mRNA bozunma oranlarını etkiler. MiRNA’ların ve hedeflerin kombinasyonları hücreyi farklı sonuçlara götürür. Birkaç miRNA, hücreleri pro- veya anti-tümöral fenotiplere yönlendirebilir13. Onkojenik miRNA’lar genellikle baskılayıcı bir özelliği tetikleyen mRNA’ları hedef alır ve bu da hücresel proliferasyon, göç ve invazyonun artmasına neden olur14. Öte yandan, tümör baskılayıcı miRNA’lar, onkojenik mRNA’ları veya artmış hücre proliferasyonuna bağlı mRNA’ları hedefleyebilir.
MiRNA’ların işlenmesi ve olgunlaşması da kökenlerine bağlıdır. Çoğu intronic miRNA, ribonükleaz Drisha ve protein ko-faktörleri12 tarafından oluşturulan mikroişlemcinin katılımıyla işlenir. Mirtronlar, Drosha15’ten bağımsız olarak splisozomun aktivitesi ile işlenir. İntronlarda bulunan miRNA’ların yüksek frekansını göz önünde bulundurarak, ekleme ile ilgili RNA bağlayıcı proteinlerin bu miRNA’ların işlenmesini ve olgunlaşmasını da kolaylaştırabileceğini varsaydık. Özellikle, RBP hnRNP A2 / B1 zaten mikroişlemci ve miRNA biyogenezi16 ile ilişkilendirilmiştir.
Daha önce hnRNP’ler ve HuR gibi birkaç RNA bağlayıcı proteinin, kütle spektrometrisi17 ile intronic miRNA’larla ilişkili olduğunu bildirmiştik. HuR’un (ELAVL1) miR-17-92 intronik kümesinden miRNA’larla ilişkisi, immünopresipitasyon ve in siliko analizi9 kullanılarak doğrulandı. miR-17-92, farklı kanserlerde ekspresyonu artmış altı miRNA’dan oluşan bir intronik miRNA kümesidir18,19. Bu küme aynı zamanda “oncomiR-1” olarak da bilinir ve miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19b ve miR-92 a’dan oluşur. miR-19 a ve miR-19b, bu küme 19’un en onkojenik miRNA’larıarasındadır. HuR’nin artan ekspresyonu miR-19a ve miR-19b sentezi 9’u uyarır. Bu kümeyi çevreleyen tronik bölgeler HuR ile ilişkili olduğundan, bu proteinin miR-19a ve miR-19b ekspresyonunu ve olgunlaşmasını düzenleyip düzenleyemeyeceğini araştırmak için bir yöntem geliştirdik. Hipotezimizin önemli bir tahmini, düzenleyici bir protein olarak HuR’nin miRNA biyogenezini kolaylaştırabileceği ve fenotipik değişikliklere yol açabileceğiydi. Bir olasılık, miRNA’ların HuR’nin uyarılmasıyla işlendiği, ancak olgun ve işlevsel olmayacağı ve bu nedenle proteinin etkilerinin fenotipi doğrudan etkilemeyeceğiydi. Bu nedenle, HuR gibi bir RBP’nin intronic bir miRNA’nın biyogenezini ve olgunlaşmasını etkileyip etkilemediğini araştırmak için bir ekleme muhabiri testi geliştirdik. MiRNA işlemeyi ve olgunlaşmasını doğrulayarak, tahlilimiz hedef sekans ile etkileşimi ve olgun ve fonksiyonel bir miRNA’nın oluşumunu gösterir. Tahlilimizde, kültürlenmiş hücrelerde miRNA hedef bağlanmasını kontrol etmek için bir intronic miRNA kümesinin ekspresyonunu bir lusiferaz plazmidi ile birleştiriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pre-mRNA ekleme, gen ekspresyon regülasyonu için önemli bir süreçtir ve kontrolü, hücre fenotipik modifikasyonları üzerinde güçlü etkileri tetikleyebilir22,23. MiRNA’ların% 70’inden fazlası insanlardaki intronlardan kopyalanır ve bunların işlenmesinin ve olgunlaşmasının, düzenleyici proteinlerin24,25 eklenmesiyle kolaylaştırılabileceğini varsaydık. Kültürlü hücrelerde introni…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, HeLa-Cre hücreleri ve pRD-RIPE ve pCAGGS-Cre plazmidleri için E. Makeyev’e (Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur) minnettardır. Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes ve Anselmo Moriscot’a destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
- Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
- Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
- Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
- Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
- Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
- Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
- Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
- Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
- Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
- Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
- Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
- Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
- Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Recherche en cancérologie. 76 (6), 1549-1559 (2016).
- Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
- Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).
