क्रोहन रोग में यांत्रिक तनाव की रोगजनक भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक टीएनबीएस-प्रेरित कृंतक मॉडल
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कृन्तकों में एक क्रोहन-जैसे कोलाइटिस मॉडल के विकास का वर्णन करता है। ट्रांसम्यूरल सूजन टीएनबीएस इंस्टिलेशन साइट पर स्टेनोसिस की ओर जाता है, और स्टेनोसिस के समीपस्थ खंड में यांत्रिक वृद्धि देखी जाती है। ये परिवर्तन कोलाइटिस में यांत्रिक तनाव का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं।
Abstract
सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) जैसे कि क्रोहन रोग (सीडी) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के पुराने भड़काऊ विकार हैं जो यूरोप और संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 20 प्रति 1,00,000 को प्रभावित करते हैं। सीडी को ट्रांसम्यूरल सूजन, आंतों के फाइब्रोसिस और ल्यूमिनल स्टेनोसिस की विशेषता है। हालांकि विरोधी भड़काऊ उपचार सूजन को नियंत्रित करने में मदद कर सकते हैं, उनके पास सीडी में फाइब्रोसिस और स्टेनोसिस पर कोई प्रभावकारिता नहीं है। सीडी के रोगजनन को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। वर्तमान अध्ययन मुख्य रूप से डिस्रेगुलेटेड आंत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तंत्र को चित्रित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। जबकि सीडी से जुड़े ट्रांसम्यूरल सूजन, आंतों के फाइब्रोसिस, और ल्यूमिनल स्टेनोसिस सभी आंत की दीवार के लिए यांत्रिक तनाव का प्रतिनिधित्व करते हैं, सीडी में यांत्रिक तनाव की भूमिका अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यांत्रिक तनाव सीडी में एक स्वतंत्र रोगजनक भूमिका निभाता है, कृन्तकों में टीएनबीएस-प्रेरित सीडी-जैसे कोलाइटिस मॉडल का एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। यह टीएनबीएस-प्रेरित ट्रांसम्यूरल सूजन और फाइब्रोसिस मॉडल बृहदान्त्र में सीडी के पैथोलॉजिकल हॉलमार्क जैसा दिखता है। यह वयस्क स्प्राग-डॉली चूहों के डिस्टल बृहदान्त्र में टीएनबीएस के इंट्राकोलोनिक इनस्टिलेटेशन द्वारा प्रेरित होता है। इस मॉडल में, ट्रांसम्यूरल सूजन टीएनबीएस इंस्टिलेशन साइट (साइट I) पर स्टेनोसिस की ओर जाता है। यांत्रिक विघटन instillation साइट (साइट पी) के समीपस्थ भाग में मनाया जाता है, यांत्रिक तनाव का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन दिखाई देने वाली सूजन नहीं है। Colonic भाग सूजन (साइट डी) के लिए दूरस्थ न तो सूजन और न ही यांत्रिक तनाव प्रस्तुत करता है। जीन अभिव्यक्ति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, फाइब्रोसिस, और विभिन्न साइटों (पी, आई, और डी) पर चिकनी मांसपेशियों के विकास के विशिष्ट परिवर्तन देखे गए, जो यांत्रिक तनाव के गहन प्रभाव को उजागर करते हैं। इसलिए, सीडी-जैसे कोलाइटिस का यह मॉडल हमें सीडी के रोगजनक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगा, विशेष रूप से यांत्रिक तनाव और यांत्रिक तनाव-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति की भूमिका प्रतिरक्षा विकृति, आंतों के फाइब्रोसिस और सीडी में ऊतक रीमॉडलिंग में।
Introduction
अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) और क्रोहन रोग (सीडी) सहित सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ में पुरानी सूजन की विशेषता है। यह ~ 1-2 मिलियन अमेरिकियों को प्रभावित करताहै। अमेरिका में आईबीडी देखभाल के लिए अनुमानित वार्षिक लागत $ 11.8 बिलियन है। यूसी के विपरीत, सीडी को ट्रांसम्यूरल सूजन और सख्त गठन 2,3 की विशेषता है। सख्त गठन (स्टेनोसिस) सीडी रोगियों के 70% तक होता है3 और ट्रांसम्यूरल सूजन (भड़काऊ स्टेनोसिस) या आंतों के फाइब्रोसिस (फाइब्रोटिक स्टेनोसिस) 4,5 के कारण हो सकता है। आंत्र फाइब्रोसिस अत्यधिक कोलेजन जमाव और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी) के साथ अन्य बाह्य कोशिकीय आव्यूहों (ईसीएम) की विशेषता है, जो प्रक्रिया में शामिल मुख्य मेसेनकाइमल सेल प्रकारों में से एक के रूप मेंहै 3,4। हाइपरट्रॉफी से जुड़ी चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया सीडी6 में फाइब्रोटिक स्टेनोसिस में एक और महत्वपूर्ण हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन है। हालांकि सीडी में सख्ती का गठन पुरानी सूजन से जुड़ा हुआ है, सर्जिकल उपचार 2,6 को छोड़कर कोई विरोधी भड़काऊ उपचार प्रभावी नहीं है। हालांकि, सर्जरी के बाद की पुनरावृत्ति लगभग 100% है, पर्याप्त समय 2,7 दिया गया है। एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के रूप में, फाइब्रोसिस और एसएमसी हाइपरप्लासिया आंत 8,9 में गैर-भड़काऊ स्थितियों (यानी, आंत्र बाधा) में भी विकसित हो सकते हैं; यह माना जाता है कि दोनों सूजन-निर्भर और स्वतंत्र तंत्र सख्त गठन 3,4 में शामिल हैं। यह देखते हुए कि सूजन-निर्भर तंत्र में व्यापक शोध ने सख्ती के गठन के लिए किसी भी प्रभावी चिकित्सा में अनुवाद नहीं किया है, आंतों के फाइब्रोसिस में सूजन-स्वतंत्र तंत्र की संभावित भूमिका में अध्ययन की आवश्यकता है।
एक गैर-भड़काऊ कारक के रूप में, एडिमा, भड़काऊ सेल घुसपैठ, ऊतक विरूपण, फाइब्रोसिस, और स्टेनोसिस 10,11,12,13 से जुड़े यांत्रिक तनाव (एमएस) आमतौर पर आईबीडी, विशेष रूप से सीडी में सामना किया जाता है, जो ट्रांसम्यूरल सूजन की विशेषता है। स्टेनोटिक सीडी में यांत्रिक तनाव सबसे उल्लेखनीय है, जहां सूजन साइट में स्टेनोसिस (भड़काऊ या फाइब्रोटिक) स्थानीय ऊतक में यांत्रिक तनाव प्रस्तुत करता है और बाधा स्थल10,14 के समीपस्थ खंड में लुमेन डिस्टेंशन की ओर जाता है। पिछले इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि यांत्रिक तनाव जठरांत्र संबंधी ऊतकों में विशिष्ट भड़काऊ मध्यस्थों (यानी, COX-2, IL-6)8,14,15 और विकास कारकों (यानी, TGF-β) की जीन अभिव्यक्ति को बदल देता है, विशेष रूप से आंत चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMC)16। हाल के अध्ययनों में यह भी पाया गया कि संयोजी ऊतक विकास कारक (सीटीजीएफ) जैसे विशिष्ट प्रो-फाइब्रोटिक मध्यस्थों की अभिव्यक्ति यांत्रिक तनाव17,18 के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। यह परिकल्पना की गई थी कि यांत्रिक तनाव सीडी से जुड़ी सूजन, फाइब्रोसिस और ऊतक रीमॉडलिंग में एक स्वतंत्र रोगजनक भूमिका निभा सकता है। हालांकि, आंत की सूजन, फाइब्रोसिस, और सीडी में चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया में यांत्रिक तनाव का रोगजनक महत्व काफी हद तक अज्ञात रहता है। यह आंशिक रूप से हो सकता है क्योंकि सूजन यांत्रिक तनाव की तुलना में अधिक दृश्यमान और बेहतर अध्ययन की गई प्रक्रिया है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि आईबीडी का कोई अच्छी तरह से परिभाषित पशु मॉडल नहीं है जो यांत्रिक तनाव के प्रभाव को सूजन से अलग करता है।
वर्तमान कार्य क्रोहन की तरह कोलाइटिस के एक कृंतक मॉडल का वर्णन करता है जो हैप्टेन अभिकर्मक 2,4,6-ट्राइनाइट्रोबेंजीन सल्फोनिक एसिड (टीएनबीएस) 19,20 के इंट्राकोलोनिक इंजेक्शन से प्रेरित है, जो सीडी में यांत्रिक तनाव की भूमिका का अध्ययन करने के उद्देश्य की सेवा कर सकता है। यह पाया गया कि टीएनबीएस इनस्टिलेटेशन ने डिस्टल बृहदान्त्र में लुमेन संकीर्णता (स्टेनोसिस) के साथ एक स्थानीयकृत (~ 2 सेमी लंबाई में) ट्रांसम्यूरल सूजन को प्रेरित किया। स्टेनोसिस चिह्नित आंत्र विघटन (यांत्रिक तनाव) 14,15 की ओर जाता है, लेकिन कोलोनिक सेगमेंट में दिखाई देने वाली सूजन नहीं होती है जो इंस्टिलेशन साइट के समीपस्थ होती है। इसके विपरीत, स्टेनोसिस साइट के लिए बृहदान्त्र खंड डिस्टल न तो सूजन और न ही यांत्रिक तनाव प्रस्तुत करता है। जीन अभिव्यक्ति, सूजन, फाइब्रोसिस और एसएमसी हाइपरप्लासिया में महत्वपूर्ण साइट-विशिष्ट परिवर्तन तीन अलग-अलग साइटों में देखे गए थे। परिणाम बताते हैं कि यांत्रिक तनाव, विशेष रूप से यांत्रिक तनाव-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति, क्रोहन कोलाइटिस में फाइब्रोसिस और हाइपरप्लासिया विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टीएनबीएस-प्रेरित कोलाइटिस को 1989 में पेश किया गया था और तब से19,20,23 के बाद से क्रोहन रोग के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। कृन्तकों में इस मॉडल की मह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच (R01 DK124611 से XZS) और अमेरिकी रक्षा विभाग (W81XWH-20-1-0681 से XZS) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित है। यूटीएमबी सर्जिकल पैथोलॉजी लैब की मदद से हिस्टोलॉजी का काम किया गया था।
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
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