Um modelo de remodelação vascular reversa na hipertensão pulmonar devido a doença cardíaca esquerda por debandada de aórtica em ratos

Summary

O presente protocolo descreve um procedimento cirúrgico para remover a faixa ascendente-aórtica em um modelo de rato de hipertensão pulmonar devido a doença cardíaca esquerda. Esta técnica estuda mecanismos endógenos de remodelação reversa na circulação pulmonar e no coração direito, informando estratégias para reverter a hipertensão pulmonar e/ou disfunção ventricular direita.

Abstract

A hipertensão pulmonar devido à doença cardíaca esquerda (PH-LHD) é a forma mais comum de PH, mas sua fisiopatologia é pouco caracterizada do que a hipertensão arterial pulmonar (AP). Como resultado, faltam intervenções terapêuticas aprovadas para o tratamento ou prevenção da PH-LHD. Medicamentos utilizados para tratar PH em pacientes com APS não são recomendados para o tratamento de PH-LHD, pois a redução da resistência vascular pulmonar (PVR) e o aumento do fluxo sanguíneo pulmonar na presença de aumento das pressões de enchimento do lado esquerdo podem causar descompensação do coração esquerdo e edema pulmonar. Novas estratégias precisam ser desenvolvidas para reverter o PH em pacientes com LHD. Em contraste com o PAH, o PH-LHD desenvolve-se devido ao aumento da carga mecânica causada pelo congestionamento do sangue na circulação pulmonar durante a insuficiência cardíaca esquerda. Clinicamente, o descarregamento mecânico do ventrículo esquerdo (LV) por substituição da válvula aórtica em pacientes com estenose aórtica ou pela implantação de dispositivos auxiliares de LV em pacientes com insuficiência cardíaca em estágio final normaliza não apenas pressões pulmonares e ventriculares direitas (RV), mas também PVR, fornecendo evidências indiretas para remodelação reversa na vasculatura pulmonar. Utilizando um modelo de rato estabelecido de PH-LHD devido à insuficiência cardíaca esquerda desencadeada pela sobrecarga de pressão com o desenvolvimento subsequente de PH, um modelo é desenvolvido para estudar os mecanismos moleculares e celulares deste processo fisiológico de remodelação reversa. Especificamente, foi realizada uma cirurgia de debandada de aoórtica, que resultou na remodelação reversa do miocárdio lv e sua descarga. Em paralelo, foi detectável a normalização completa da pressão sistólica do RV e a reversão significativa, mas incompleta, da hipertrofia do RV. Este modelo pode apresentar uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos de remodelação fisiológica reversa na circulação pulmonar e no RV, visando desenvolver estratégias terapêuticas para o tratamento do PH-LHD e outras formas de PH.

Introduction

A insuficiência cardíaca é a principal causa de morte nos países desenvolvidos e deve aumentar 25% na próxima década. A hipertensão pulmonar (PH) – um aumento patológico da pressão arterial na circulação pulmonar – afeta aproximadamente 70% dos pacientes com insuficiência cardíaca em estágio terminal; a Organização Mundial da Saúde classifica a PH como hipertensão pulmonar devido à doença cardíaca esquerda (PH-LHD)¹. O PH-LHD é iniciado pela função ventricular esquerda (LV) sistólica e/ou diastólica prejudicada que resulta em pressão de enchimento elevada e congestão passiva de sangue na circulação pulmonar². Embora inicialmente reversível, o PH-LHD gradualmente se fixa devido à remodelação vascular pulmonar ativa em todos os compartimentos da circulação pulmonar, ou seja, artérias, capilares e veias ^3,4. Tanto o PH reversível quanto o PH fixo aumentam a carga posterior do RV, inicialmente conduzindo hipertrofia miocárdio adaptativa, mas, em última análise, causando dilatação de RV, hipocinese, fibrose e descompensação que progressivamente levam à falha do RV 1,2,5,6. Assim, a AP acelera a progressão da doença em pacientes com insuficiência cardíaca e aumenta a mortalidade, particularmente em pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico por implantação de dispositivos de assistência ventricular esquerda (LVAD) e/ou transplante de coração ^7,8,9. Atualmente, não existem terapias curativas que possam reverter o processo de remodelação vascular pulmonar, por isso são necessárias pesquisas mecanicistas fundamentais em sistemas de modelos adequados.

É importante ressaltar que os estudos clínicos mostram que o PH-LHD como uma complicação frequente em pacientes com estenose aórtica pode melhorar rapidamente no período pós-operatório inicial após a substituição da válvula aórtica¹⁰. Análogamente, alta (>3 Unidades de Madeira) resistência vascular pulmonar pré-operatória (PVR) que era, no entanto, reversível em nitroprusside foi sustentávelmente normalizada após o transplante de coração em um estudo de acompanhamento de 5 anos¹¹. Da mesma forma, uma redução adequada da PVR reversível e fixa e a melhoria da função RV em pacientes com LHD poderiam ser realizadas dentro de vários meses, descarregando o ventrículo esquerdo usando dispositivos de assistência ventricular pulsal e não pulsante 12,13,14. Atualmente, os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a remodelação reversa na circulação pulmonar e no miocárdio rv não são claros. No entanto, sua compreensão pode fornecer uma visão importante sobre vias fisiológicas que podem ser exploradas terapeuticamente para reverter a remodelação vascular pulmonar e rv em PH-LHD e outras formas de PH.

Um modelo pré-clínico adequado que replica adequadamente as características fisiopatológicas e moleculares do PH-LHD pode ser usado para estudos translacionais em insuficiência cardíaca congestiva induzida por sobrecarga de pressão devido à banda aórtica cirúrgica (AoB) em ratos ^4,15,16. Em comparação com a insuficiência cardíaca semelhante devido à sobrecarga de pressão no modelo murino de constrição aórtica transversa (TAC)¹⁷, a banda da aorta ascendente acima da raiz aórtica em ratos AoB não produz hipertensão na artéria carótida esquerda, pois o local de banda é proximal do fluxo da artéria carótida esquerda da aorta. Como resultado, o AoB não causa lesão neuronal do lado esquerdo no córtex como é característico do TAC¹⁸, e que pode afetar o resultado do estudo. Em comparação com outros modelos de roedores de PH-LHD cirurgicamente induzidos, modelos de ratos em geral, e AoB em particular, provam ser mais robustos, reprodutíveis e replicar a remodelagem da característica de circulação pulmonar para pacientes com PH-LHD. Ao mesmo tempo, a letalidade perioperatória é baixa^{de 19}. O aumento das pressões de LV e a disfunção de LV em ratos aoB induzem o desenvolvimento de PH-LHD, resultando em pressões elevadas de RV e remodelação de RV. Como tal, o modelo de ratos aoB tem se mostrado extremamente útil em uma série de estudos anteriores por grupos independentes, incluindo nós mesmos, para identificar pathomecanismos de remodelação vascular pulmonar e testar estratégias potenciais de tratamento para PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.

No presente estudo, o modelo de rato AoB foi utilizado para estabelecer um procedimento cirúrgico de debandagem aórtica para estudar mecanismos de remodelação reversa na vasculatura pulmonar e no RV. Anteriormente, modelos de remodelação reversa do miocárdio, como a debandagem aórtica em camundongos²⁶ e ratos²⁷ foram desenvolvidos para investigar os mecanismos celulares e moleculares que regulam a regressão da hipertrofia ventricular esquerda e testar potenciais opções terapêuticas para promover o miocárdio recuperação. Além disso, um número limitado de estudos anteriores têm explorado os efeitos da debandada aórtica no PH-LHD em ratos e mostrado que a debandada aórtica pode reverter a hipertrofia medial em artérias pulmonares, normalizar a expressão da pré-endotelina 1 e melhorar a hemodinâmica pulmonar^27,28, fornecendo evidências para a reversibilidade de PH em ratos com insuficiência cardíaca. Aqui, os procedimentos técnicos da cirurgia de desbandada são otimizados e padronizados, por exemplo, aplicando uma traqueotomia em vez de intubação endotraqueal ou utilizando clipes de titânio de diâmetro interno definido para banda aórtica em vez de suturas de polipropileno com agulha cega ^26,27, proporcionando assim melhor controle dos procedimentos cirúrgicos, maior reprodutibilidade do modelo e uma melhor taxa de sobrevivência.

Do ponto de vista científico, a importância do modelo de desbanding ph-LHD não reside apenas em demonstrar a reversibilidade do fenótipo cardiovascular e pulmonar na insuficiência cardíaca, mas, mais importante, na identificação de condutores moleculares que desencadeiam e/ou sustentam a remodelação reversa nas artérias pulmonares como candidatos promissores para futuras segmentações terapêuticas.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados seguindo o “Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório” (Instituto de Recursos Animais laboratoriais, 8ª edição 2011) e aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais governamentais locais do Escritório Estadual alemão de Saúde e Assuntos Sociais (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlim; protocolo nº. G0030/18). Primeiro, a insuficiência cardíaca congestiva foi cirurgicamente induzida em ratos juvenis Sprague-Dawley ~100 g de peso corporal (bw) (…

Representative Results

Primeiro, o debandado aórtico bem sucedido foi confirmado pela ecocardiografia transtorácica realizada antes e depois do procedimento de debandada em animais aoB (Figura 6). Para isso, o arco aórtico foi avaliado na visualização do modo B do eixo longo parasternal (PLAX). A posição do clipe na aorta ascendente em animais AoB e sua ausência após a cirurgia de Deb foi visualizada (Figura 6A,B). Em seguida, o fluxo sanguíneo aórtico foi …

Discussion

Aqui, é relatada uma técnica cirúrgica detalhada para debandar aórtico em um modelo aob de rato que pode ser utilizada para investigar a reversibilidade do PH-LHD e os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a remodelação reversa na vasculatura pulmonar e no RV. Três semanas de constrição aórtica em ratos juvenis resultam em PH-LHD evidente como aumento das pressões de LV, hipertrofia lv, e concomitantemente aumentado pressões de RV e hipertrofia rv. A debandagem do aórtico na semana 3 pós-AoB fo…

Materials

Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic