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Chimie

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

Published: February 07, 2022
doi:
10.3791/63503
, , , , ,
1Department of Chemistry,Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。

Abstract

質量分析(MS)機器の複数の進歩により、定性的および定量的プロテオーム分析が改善されましたが、MSに先んじてタンパク質を単離、濃縮、および処理するためのより信頼性の高いフロントエンドアプローチは、プロテオーム特性評価を成功させるために不可欠です。低く、一貫性のないタンパク質回収率および界面活性剤などの残留不純物は、MS分析に有害である。タンパク質沈殿は、他のサンプル調製戦略と比較して、信頼性が低く、時間がかかり、技術的に実行が難しいと考えられがちです。これらの懸念は、最適なタンパク質沈殿プロトコルを採用することによって克服されます。アセトン沈殿の場合、特定の塩、温度制御、溶媒組成、および沈殿時間の組み合わせが重要ですが、クロロホルム/メタノール/水沈殿の効率は適切なピペッティングとバイアル操作に依存します。あるいは、これらの沈殿プロトコルは、使い捨てスピンカートリッジ内で合理化され、半自動化されています。従来の形式で、使い捨ての2段階ろ過および抽出カートリッジを使用した溶媒ベースのタンパク質沈殿の予想される結果を、この研究で示します。これには、ボトムアップのLC-MS/MS 分析によるプロテオーム混合物の詳細な特性評価が含まれます。SDSベースのワークフローの優れた性能は、非汚染タンパク質と比較しても実証されています。

Introduction

質量分析によるプロテオーム分析は、最新のMS機器の感度、分解能、スキャン速度、汎用性の向上により、ますます厳格になっています。MSの進歩は、より高いタンパク質同定効率およびより正確な定量1,2,3,4,5に寄与する。改善されたMS機器により、研究者は、ワークフローのすべての段階で最小限の時間で高純度タンパク質を定量回収できる、それに対応して一貫したフロントエンドサンプル調製戦略を求めています6,7,8,9,10,11 .生物学的系のプロテオーム状態を正確に反映するには、タンパク質を効率的かつ偏りのない方法で天然のサンプルマトリックスから単離する必要があります。この目的のために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性界面活性剤を含む、効率的なタンパク質抽出および可溶化12を保証する。しかし、SDSはエレクトロスプレーイオン化を強く妨害し、適切に排除しないと厳しいMS信号抑制を引き起こす13。

使い捨てスピンカートリッジ14、15、16内に含まれる分子量カットオフフィルターを超えるタンパク質の保持など、その後のプロテオーム分析のために様々なSDS枯渇戦略が利用可能である。フィルター支援サンプル調製法(FASP)は、10ppm未満のSDSを効果的に枯渇させ、最適なMSを容易にするため、好まれています。しかし、FASPによるタンパク質回収は可変であり、これが他の技術の探求を促した。タンパク質(または界面活性剤)を選択的に捕捉するクロマトグラフィーアプローチは、様々な便利なカートリッジまたはビーズベースのフォーマットに進化してきた17、18、19、20、21。タンパク質精製に対するこれらの単純で(理想的には)一貫した戦略を考えると、有機溶媒によるタンパク質沈殿の古典的なアプローチは、タンパク質単離への有望なアプローチとして見過ごされがちです。溶媒沈殿はSDSを臨界レベル以下に正常に枯渇させることが示されていますが、タンパク質回収はこのアプローチの長年の懸念事項でした。複数のグループがタンパク質回収バイアスを観察しており、タンパク質濃度、分子量、疎水性の関数として許容できないほど低い沈殿収率で22,23。文献で報告された沈殿プロトコルの多様性のために、標準化された沈殿条件が開発された。2013年、Crowellらは、80%アセトン24中のタンパク質の沈殿効率に対するイオン強度の依存性を最初に報告した。調べたすべてのタンパク質について、最大30mM塩化ナトリウムの添加は、収量を最大化する(最大100%回収)ために不可欠であることが示された。より最近では、Nickersonらは、アセトン沈殿中のさらに高いイオン強度(最大100mM)と高温(20°C)の組み合わせが、2〜5分25分でほぼ定量的な回復をもたらすことを示した。低分子量(LMW)タンパク質の回収率のわずかな低下が観察された。したがって、Baghalabadiらによるその後の報告では、特定の塩、特に硫酸亜鉛をより高いレベルの有機溶媒(97%アセトン)と組み合わせることによって、LMWタンパク質およびペプチド(≤5kDa)の回収に成功したことが実証されました26。

沈殿プロトコルを精製することで、MSベースのプロテオミクスのタンパク質精製戦略がより信頼性の高いものになりますが、従来の沈殿の成功はユーザーの技術に大きく依存しています。この研究の主な目的は、汚染上清からのタンパク質ペレットの単離を容易にする堅牢な沈殿戦略を提示することです。使い捨てろ過カートリッジは、多孔質PTFEメンブレンフィルター27の上に凝集タンパク質を単離することによってピペッティングを排除するために開発された。上清中のMS干渉成分は、短時間の低速遠心分離工程で効果的に除去されます。使い捨てフィルターカートリッジは、交換可能なSPEカートリッジも提供しており、質量分析に先立って、再可溶化とオプションのタンパク質消化後の後続のサンプルクリーンアップを容易にします。

ここでは、修正アセトンおよびクロロホルム/メタノール/水28 プロトコルを含む一連の推奨プロテオーム沈殿ワークフローを、従来の(バイアルベース)および使い捨ての2状態ろ過および抽出カートリッジの半自動形式で紹介します。得られたタンパク質回収率とSDS枯渇効率をボトムアップのLC-MS/MSプロテオームカバレッジとともに強調し、各プロトコルから期待される結果を実証します。各アプローチに関連する実用的な利点と欠点について説明します。

Protocol

1. 材料に関する考慮事項とサンプルの事前準備 高純度の溶媒(アセトン、クロロホルム、メタノール)(>99.5%)と化学薬品のみを使用し、余分な水分を含まない。 水に塩化ナトリウムと硫酸亜鉛の溶液(1 M)を調製する。注:塩溶液は、汚染物質または微生物の増殖がない限り、室温で無期限に保存することができます。 沈殿を誘導するために必要な量のサンプ…

Representative Results

図4 は、アセトンを用いた使い捨てフィルターカートリッジ中のタンパク質のバイアルベースまたはカートリッジ促進沈殿に続く予想されるSDS枯渇を要約する。アセトン中での従来の一晩インキュベーション(−20°C)は、室温での迅速なアセトン沈殿プロトコル(ステップ2)、ならびにCMW沈殿(ステップ4)と比較される。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイ<sup cl…

Discussion

最適なMS特性評価は、残留SDSが10ppm未満で枯渇すると達成されます。FASPやビーズ上消化などの代替アプローチは、可変回収率31、32、33で定量的なSDS枯渇を提供しますが、沈殿の主な目的は純度と収率を同時に最大化することです。これは、タンパク質ペレットを乱すことなく上清(SDSを含む)を効果的に単離することに依存?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会から資金提供を受けました。著者らは、MSデータの取得に貢献してくれたBioinformatics Solutions Inc.(カナダ、ウォータールー)とHospital for Sick Children(トロント、カナダ)のSPARC BioCenter(Molecular Analysis)に感謝する。

Materials

Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid
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References

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Citer Cet Article
Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).
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