मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले मजबूत प्रोटिओम शुद्धिकरण के लिए कार्बनिक विलायक-आधारित प्रोटीन वर्षा
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल मजबूत और तेजी से वसूली और मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले प्रोटिओम नमूनों की शुद्धि के लिए नियंत्रित परिस्थितियों में विलायक आधारित प्रोटीन वर्षा का वर्णन करता है।
Abstract
जबकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) उपकरणों में कई प्रगति ने गुणात्मक और मात्रात्मक प्रोटिओम विश्लेषण में सुधार किया है, एमएस से पहले प्रोटीन को अलग करने, समृद्ध करने और संसाधित करने के लिए अधिक विश्वसनीय फ्रंट-एंड दृष्टिकोण सफल प्रोटिओम लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण हैं। कम, असंगत प्रोटीन वसूली और अवशिष्ट अशुद्धियां जैसे सर्फेक्टेंट एमएस विश्लेषण के लिए हानिकारक हैं। प्रोटीन वर्षा को अक्सर अन्य नमूना तैयारी रणनीतियों की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए अविश्वसनीय, समय लेने वाली और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण माना जाता है। इष्टतम प्रोटीन वर्षा प्रोटोकॉल को नियोजित करके इन चिंताओं को दूर किया जाता है। एसीटोन वर्षा के लिए, विशिष्ट लवण, तापमान नियंत्रण, विलायक संरचना और वर्षा समय का संयोजन महत्वपूर्ण है, जबकि क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / पानी की वर्षा की दक्षता उचित पाइपिंग और शीशी हेरफेर पर निर्भर करती है। वैकल्पिक रूप से, इन वर्षा प्रोटोकॉल एक डिस्पोजेबल स्पिन कारतूस के भीतर सुव्यवस्थित और अर्ध-स्वचालित हैं। पारंपरिक प्रारूप में विलायक-आधारित प्रोटीन वर्षा के अपेक्षित परिणाम और एक डिस्पोजेबल, दो-चरण निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस का उपयोग करना इस काम में सचित्र हैं। इसमें बॉटम-अप एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण द्वारा प्रोटिओमिक मिश्रण का विस्तृत लक्षण वर्णन शामिल है। एसडीएस-आधारित वर्कफ़्लो का बेहतर प्रदर्शन गैर-दूषित प्रोटीन के सापेक्ष भी प्रदर्शित किया जाता है।
Introduction
आधुनिक एमएस उपकरणों की बढ़ी हुई संवेदनशीलता, संकल्प, स्कैन गति और बहुमुखी प्रतिभा के कारण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटिओम विश्लेषण तेजी से कठोर हो गया है। एमएस अग्रिम अधिक प्रोटीन पहचान दक्षता और अधिक सटीक मात्रा 1,2,3,4,5 में योगदान करते हैं। बेहतर एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ, शोधकर्ता वर्कफ़्लो 6,7,8,9,10,11 के सभी चरणों में न्यूनतम समय में उच्च शुद्धता वाले प्रोटीन की मात्रात्मक वसूली में सक्षम एक सुसंगत फ्रंट-एंड नमूना तैयारी रणनीति की मांग करते हैं . एक जैविक प्रणाली की प्रोटिओम स्थिति को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने के लिए, प्रोटीन को एक कुशल और निष्पक्ष फैशन में देशी नमूना मैट्रिक्स से अलग किया जाना चाहिए। यह अंत करने के लिए, एक विकृत सर्फेक्टेंट सहित, जैसे कि सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), कुशल प्रोटीन निष्कर्षण और घुलनशीलता12 सुनिश्चित करता है। हालांकि, एसडीएस इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण के साथ दृढ़ता से हस्तक्षेप करता है, जिससे गंभीर एमएस सिग्नल दमन होता है यदि ठीक से समाप्त नहीं होताहै 13.
बाद के प्रोटिओम विश्लेषण के लिए विभिन्न एसडीएस कमी रणनीतियां उपलब्ध हैं, जैसे डिस्पोजेबल स्पिन कारतूस14,15,16 के भीतर निहित आणविक भार कटऑफ फिल्टर के ऊपर प्रोटीन का प्रतिधारण। फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी विधि (एफएएसपी) इष्ट है क्योंकि यह प्रभावी रूप से 10 पीपीएम से नीचे एसडीएस को कम करता है, इष्टतम एमएस की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, एफएएसपी के साथ प्रोटीन रिकवरी परिवर्तनशील है, जिसने अन्य तकनीकों की खोज को प्रेरित किया। क्रोमैटोग्राफिक दृष्टिकोण जो चुनिंदा रूप से प्रोटीन (या सर्फैक्टेंट) को कैप्चर करते हैं, विभिन्न सुविधाजनक कारतूस या मनका-आधारित प्रारूपों 17,18,19,20,21 में विकसित हुए हैं। प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए इन सरल और (आदर्श रूप से) सुसंगत रणनीतियों को देखते हुए, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ प्रोटीन वर्षा के शास्त्रीय दृष्टिकोण को अक्सर प्रोटीन अलगाव के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में अनदेखा किया जाता है। जबकि विलायक वर्षा को महत्वपूर्ण स्तरों से नीचे एसडीएस को सफलतापूर्वक समाप्त करने के लिए दिखाया गया है, प्रोटीन वसूली इस दृष्टिकोण की लंबे समय से चिंता का विषय रही है। कई समूहों ने प्रोटीन एकाग्रता, आणविक भार और हाइड्रोफोबिसिटी22,23 के एक समारोह के रूप में अस्वीकार्य रूप से कम वर्षा पैदावार के साथ एक प्रोटीन रिकवरी पूर्वाग्रह देखा है। साहित्य में रिपोर्ट किए गए वर्षा प्रोटोकॉल की विविधता के कारण, मानकीकृत वर्षा की स्थिति विकसित की गई थी। 2013 में, क्रॉवेल एट अल ने पहली बार 80% एसीटोन24 में प्रोटीन की वर्षा दक्षता पर आयनिक ताकत की निर्भरता की सूचना दी। जांच किए गए सभी प्रोटीनों के लिए, पैदावार को अधिकतम करने के लिए 30 एमएम सोडियम क्लोराइड के अलावा आवश्यक दिखाया गया था (100% वसूली तक)। हाल ही में, निकर्सन एट अल ने दिखाया कि एसीटोन वर्षा के दौरान ऊंचा तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) के साथ और भी उच्च आयनिक ताकत (100 एमएम तक) का संयोजन 2-5 मिनट25 में मात्रात्मक वसूली के पास दिया गया। कम आणविक भार (एलएमडब्ल्यू) प्रोटीन की वसूली में मामूली गिरावट देखी गई। इसलिए, बाघलाबादी एट अल की एक बाद की रिपोर्ट ने कार्बनिक विलायक (97% एसीटोन) 26 के उच्च स्तर के साथ विशिष्ट लवण, विशेष रूप से जस्ता सल्फेट के संयोजन से एलएमडब्ल्यू प्रोटीन और पेप्टाइड्स (≤5 केडीए) की सफल वसूली का प्रदर्शन किया।
वर्षा प्रोटोकॉल को परिष्कृत करते समय एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए एक अधिक विश्वसनीय प्रोटीन शोधन रणनीति उधार देता है, पारंपरिक वर्षा की सफलता उपयोगकर्ता तकनीक पर बहुत अधिक निर्भर करती है। इस काम का एक प्राथमिक लक्ष्य एक मजबूत वर्षा रणनीति पेश करना है जो दूषित सतह पर तैरनेवाला से प्रोटीन गोली के अलगाव की सुविधा प्रदान करता है। एक छिद्रपूर्ण पीटीएफई झिल्ली फिल्टर27 के ऊपर एकत्रित प्रोटीन को अलग करके पाइपिंग को खत्म करने के लिए एक डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस विकसित किया गया था। सतह पर तैरनेवाला में एमएस-हस्तक्षेप घटकों को एक छोटे, कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण में प्रभावी ढंग से हटा दिया जाता है। डिस्पोजेबल फिल्टर कारतूस भी एक विनिमेय एसपीई कारतूस प्रदान करता है, जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले, पुनरुत्थान और वैकल्पिक प्रोटीन पाचन के बाद बाद के नमूने की सफाई की सुविधा प्रदान करता है।
अनुशंसित प्रोटिओम वर्षा वर्कफ़्लो की एक श्रृंखला यहां प्रस्तुत की गई है, जिसमें संशोधित एसीटोन और क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / पानी28 प्रोटोकॉल शामिल हैं, एक पारंपरिक (शीशी-आधारित) और डिस्पोजेबल दो-राज्य निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस में एक अर्ध-स्वचालित प्रारूप में। परिणामी प्रोटीन रिकवरी और एसडीएस की कमी क्षमता को हाइलाइट किया जाता है, साथ ही प्रत्येक प्रोटोकॉल से अपेक्षित परिणाम प्रदर्शित करने के लिए नीचे-ऊपर एलसी-एमएस / प्रत्येक दृष्टिकोण से जुड़े व्यावहारिक लाभों और कमियों पर चर्चा की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इष्टतम एमएस लक्षण वर्णन तब प्राप्त किया जाता है जब अवशिष्ट एसडीएस 10 पीपीएम से नीचे समाप्त हो जाता है। जबकि वैकल्पिक दृष्टिकोण, जैसे कि एफएएसपी और ऑन-बीड पाचन, चर वसूली31,32,33 के सा…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक एमएस डेटा के अधिग्रहण में उनके योगदान के लिए बीमार बच्चों के अस्पताल (टोरंटो, कनाडा) में जैव सूचना विज्ञान समाधान इंक (वाटरलू, कनाडा) और एसपीएआरसी बायोसेंटर (आणविक विश्लेषण) का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
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