Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa

Summary

Il presente protocollo descrive la precipitazione proteica a base solvente in condizioni controllate per il recupero e la purificazione robusti e rapidi dei campioni di proteoma prima della spettrometria di massa.

Abstract

Mentre i molteplici progressi negli strumenti di spettrometria di massa (MS) hanno migliorato l’analisi qualitativa e quantitativa del proteoma, approcci front-end più affidabili per isolare, arricchire e processare le proteine prima della SM sono fondamentali per una caratterizzazione del proteoma di successo. Il recupero proteico basso e incoerente e le impurità residue come i tensioattivi sono dannosi per l’analisi della SM. La precipitazione delle proteine è spesso considerata inaffidabile, dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente impegnativa da eseguire rispetto ad altre strategie di preparazione del campione. Queste preoccupazioni vengono superate utilizzando protocolli ottimali di precipitazione delle proteine. Per la precipitazione dell’acetone, la combinazione di sali specifici, controllo della temperatura, composizione del solvente e tempo di precipitazione è fondamentale, mentre l’efficienza della precipitazione del cloroformio / metanolo / acqua dipende dal corretto pipettaggio e manipolazione del flaconcino. In alternativa, questi protocolli di precipitazione sono semplificati e semi-automatizzati all’interno di una cartuccia di spin usa e getta. I risultati attesi della precipitazione proteica a base di solvente nel formato convenzionale e utilizzando una cartuccia di filtrazione ed estrazione monouso a due stadi sono illustrati in questo lavoro. Ciò include la caratterizzazione dettagliata delle miscele proteomiche mediante analisi LC-MS/MS bottom-up. Le prestazioni superiori dei flussi di lavoro basati su SDS sono dimostrate anche rispetto alle proteine non contaminate.

Introduction

L’analisi del proteoma mediante spettrometria di massa è diventata sempre più rigorosa, grazie alla maggiore sensibilità, risoluzione, velocità di scansione e versatilità dei moderni strumenti MS. I progressi della SM contribuiscono a una maggiore efficienza di identificazione delle proteine e a una quantificazione più precisa ^1,2,3,4,5. Con una migliore strumentazione per la SM, i ricercatori richiedono una strategia di preparazione del campione front-end corrispondentemente coerente in grado di recuperare quantitativamente proteine ad alta purezza in un tempo minimo in tutte le fasi del flusso di lavoro 6,7,8,9,10,11 . Per riflettere accuratamente lo stato del proteoma di un sistema biologico, le proteine devono essere isolate dalla matrice del campione nativo in modo efficiente e imparziale. A tal fine, l’inclusione di un tensioattivo denaturante, come il sodio dodecil solfato (SDS), garantisce un’efficiente estrazione e solubilizzazione delle proteine¹². Tuttavia, la SDS interferisce fortemente con la ionizzazione elettrospray, causando una grave soppressione del segnale MS se non adeguatamente eliminata¹³.

Varie strategie di deplezione della SDS sono disponibili per la successiva analisi del proteoma, come la ritenzione di proteine al di sopra di un filtro di taglio a peso molecolare contenuto all’interno di cartucce di spin monouso 14,15,16. Il metodo di preparazione del campione assistito da filtro (FASP) è favorito in quanto esaurisce efficacemente la SDS al di sotto di 10 ppm, facilitando la SM ottimale. Tuttavia, il recupero delle proteine con FASP è variabile, il che ha spinto l’esplorazione di altre tecniche. Gli approcci cromatografici che catturano selettivamente le proteine (o tensioattivi) si sono evoluti in varie cartucce convenienti o formati basati su perline 17,18,19,20,21. Date queste strategie semplici e (idealmente) coerenti per la purificazione delle proteine, l’approccio classico della precipitazione delle proteine con solventi organici è spesso trascurato come un approccio promettente all’isolamento proteico. Mentre la precipitazione del solvente ha dimostrato di esaurire con successo la SDS al di sotto dei livelli critici, il recupero delle proteine è stato una preoccupazione di lunga data di questo approccio. Più gruppi hanno osservato un bias di recupero delle proteine, con rese di precipitazione inaccettabilmente basse in funzione della concentrazione proteica, del peso molecolare e dell’idrofobicità^22,23. A causa della diversità dei protocolli di precipitazione riportati in letteratura, sono state sviluppate condizioni di precipitazione standardizzate. Nel 2013, Crowell et al. hanno riportato per la prima volta la dipendenza della forza ionica dall’efficienza di precipitazione delle proteine nell’80% di acetone²⁴. Per tutte le proteine esaminate, l’aggiunta di cloruro di sodio fino a 30 mM si è dimostrata essenziale per massimizzare le rese (fino al 100% di recupero). Più recentemente, Nickerson et al. hanno dimostrato che la combinazione di una forza ionica ancora più elevata (fino a 100 mM) con temperatura elevata (20 ° C) durante la precipitazione dell’acetone ha dato un recupero quasi quantitativo in 2-5 min²⁵. È stato osservato un leggero calo nel recupero delle proteine a basso peso molecolare (LMW). Pertanto, un successivo rapporto di Baghalabadi et al. ha dimostrato il successo del recupero di proteine e peptidi LMW (≤5 kDa) combinando sali specifici, in particolare solfato di zinco, con un livello più elevato di solvente organico (acetone al 97%)²⁶.

Mentre il perfezionamento del protocollo di precipitazione conferisce una strategia di purificazione delle proteine più affidabile per la proteomica basata sulla SM, il successo della precipitazione convenzionale dipende fortemente dalla tecnica dell’utente. Un obiettivo primario di questo lavoro è quello di presentare una robusta strategia di precipitazione che faciliti l’isolamento del pellet proteico dal surnatante contaminante. È stata sviluppata una cartuccia di filtrazione monouso per eliminare il pipettaggio isolando proteine aggregate sopra un filtro poroso a membrana in PTFE²⁷. I componenti che interferiscono con LA SM nel surnatante vengono efficacemente rimossi in una breve fase di centrifugazione a bassa velocità. La cartuccia filtrante monouso offre anche una cartuccia SPE intercambiabile, che facilita la successiva pulizia del campione dopo la resolubilizzazione e la digestione proteica opzionale, prima della spettrometria di massa.

Una serie di flussi di lavoro raccomandati per la precipitazione del proteoma sono presentati qui, compresi i protocolli modificati di acetone e cloroformio / metanolo / acqua²⁸ , in un formato convenzionale (basato su fiala) e semi-automatizzato in una cartuccia di filtrazione ed estrazione a due stati usa e getta. Vengono evidenziati i recuperi proteici risultanti e le efficienze di deplezione SDS, insieme alla copertura del proteoma LC-MS/MS bottom-up, per dimostrare il risultato atteso da ciascun protocollo. Vengono discussi i vantaggi pratici e gli svantaggi associati a ciascun approccio.

Protocol

1. Considerazioni sui materiali e pre-preparazione del campione Utilizzare solo solventi ad alta purezza (acetone, cloroformio, metanolo) (>99,5%) e sostanze chimiche, privi di umidità in eccesso. Preparare soluzioni di cloruro di sodio e solfato di zinco (1 M) in acqua.NOTA: le soluzioni saline possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente, purché siano prive di contaminanti o crescita microbica. Utilizzare il più piccolo flaconcino di microcentrif…

Representative Results

La Figura 4 riassume l’esaurimento SDS previsto a seguito della precipitazione di proteine basate su flaconcino o facilitata dalla cartuccia in una cartuccia filtrante monouso che utilizza acetone. L’incubazione notturna convenzionale (-20 °C) nell’acetone viene confrontata con il protocollo di precipitazione rapida dell’acetone a temperatura ambiente (fase 2), così come la precipitazione CMW (fase 4). La SDS residua è stata quantificata dal saggio dei principi attivi blu di metilene (MBA…

Discussion

La caratterizzazione ottimale della SM si ottiene quando la SDS residua è esaurita al di sotto di 10 ppm. Mentre approcci alternativi, come FASP e digestione su perline, offrono un esaurimento quantitativo della SDS con recupero variabile ^31,32,33, l’obiettivo primario delle precipitazioni è massimizzare la purezza e la resa contemporaneamente. Ciò dipende dall’isolamento efficace del surnatante (contenente la SDS) senza dist…

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid