Organisk løsemiddelbasert proteinutfelling for robust proteomrensing før massespektrometri

Summary

Denne protokollen beskriver løsningsmiddelbasert proteinutfelling under kontrollerte forhold for robust og rask gjenvinning og rensing av proteomprøver før massespektrometri.

Abstract

Mens flere fremskritt innen massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mer pålitelige front-end tilnærminger for å isolere, berike og behandle proteiner foran MS avgjørende for vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingjenvinning og gjenværende urenheter som overflateaktive stoffer er skadelig for MS-analyse. Proteinutfelling anses ofte som upålitelig, tidkrevende og teknisk utfordrende å utføre sammenlignet med andre prøveprepareringsstrategier. Disse bekymringene overvinnes ved å bruke optimale proteinutfellingsprotokoller. For acetonutfelling er kombinasjonen av spesifikke salter, temperaturkontroll, løsningsmiddelsammensetning og utfellingstid kritisk, mens effektiviteten av kloroform / metanol / vannutfelling avhenger av riktig pipettering og manipulering av hetteglass. Alternativt er disse nedbørsprotokollene strømlinjeformet og halvautomatisert i en engangsspinnpatron. De forventede resultatene av løsningsmiddelbasert proteinutfelling i konvensjonelt format og bruk av en engangs, to-trinns filtrerings- og ekstraksjonspatron er illustrert i dette arbeidet. Dette inkluderer detaljert karakterisering av proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS / MS-analyse. Den overlegne ytelsen til SDS-baserte arbeidsflyter er også demonstrert i forhold til ikke-forurenset protein.

Introduction

Proteomanalyse ved massespektrometri har blitt stadig strengere på grunn av den forbedrede følsomheten, oppløsningen, skannehastigheten og allsidigheten til moderne MS-instrumenter. MS-fremskritt bidrar til større proteinidentifikasjonseffektivitet og mer presis kvantifisering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering krever forskere en tilsvarende konsistent front-end prøveprepareringsstrategi som er i stand til kvantitativ utvinning av proteiner med høy renhet på minimal tid på tvers av alle stadier av arbeidsflyten 6,7,8,9,10,11 . For å nøyaktig gjenspeile proteomstatusen til et biologisk system, må proteiner isoleres fra den opprinnelige prøvematrisen på en effektiv og objektiv måte. For dette formål, inkludert et denaturerende overflateaktivt middel, slik som natriumdodecylsulfat (SDS), sikrer effektiv proteinekstraksjon og oppløsning¹². SDS forstyrrer imidlertid sterkt elektrosprayionisering, noe som forårsaker alvorlig MS-signalundertrykkelse hvis den ikke elimineres riktig¹³.

Ulike SDS-uttømmingsstrategier er tilgjengelige for påfølgende proteomanalyse, for eksempel oppbevaring av proteiner over et molekylvekt cutoff filter inneholdt i engangsspinnpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveprepareringsmetoden (FASP) favoriseres da den effektivt tømmer SDS under 10 ppm, noe som letter optimal MS. Imidlertid er proteinutvinning med FASP variabel, noe som førte til utforskning av andre teknikker. Kromatografiske tilnærminger som selektivt fanger protein (eller overflateaktivt middel) har utviklet seg til forskjellige praktiske patroner eller perlebaserte formater 17,18,19,20,21. Gitt disse enkle og (ideelt) konsistente strategiene for proteinrensing, blir den klassiske tilnærmingen til proteinutfelling med organiske løsningsmidler ofte oversett som en lovende tilnærming til proteinisolasjon. Mens løsningsmiddelutfelling er vist å tømme SDS under kritiske nivåer med hell, har proteinutvinning vært en langvarig bekymring for denne tilnærmingen. Flere grupper har observert en proteinutvinningsskjevhet, med uakseptabelt lave nedbørsutbytter som en funksjon av proteinkonsentrasjon, molekylvekt og hydrofobisitet^22,23. På grunn av mangfoldet av nedbørsprotokoller rapportert i litteraturen, ble standardiserte nedbørsforhold utviklet. I 2013 rapporterte Crowell og medarbeidere først avhengigheten av ionstyrke på nedbørseffektiviteten til proteiner i 80% aceton²⁴. For alle undersøkte proteiner ble tilsetningen av opptil 30 mM natriumklorid vist å være avgjørende for å maksimere utbyttet (opptil 100% utvinning). Mer nylig viste Nickerson og medarbeidere at kombinasjonen av enda høyere ionstyrke (opptil 100 mM) med forhøyet temperatur (20 °C) under acetonutfelling ga nær kvantitativ utvinning i 2-5 min²⁵. En liten nedgang i utvinningen av proteiner med lav molekylvekt (LMW) ble observert. Derfor viste en påfølgende rapport fra Baghalabadi og medarbeidere vellykket gjenvinning av LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved å kombinere spesifikke salter, spesielt sinksulfat, med et høyere nivå av organisk løsningsmiddel (97% aceton)²⁶.

Mens raffinering av nedbørsprotokollen gir en mer pålitelig proteinrensingsstrategi for MS-basert proteomikk, er suksessen til konvensjonell nedbør avhengig av brukerteknikk. Et hovedmål med dette arbeidet er å presentere en robust nedbørsstrategi som letter isoleringen av proteinpelleten fra den forurensende supernatanten. En engangsfiltreringspatron ble utviklet for å eliminere pipettering ved å isolere aggregert protein over et porøst^{PTFE-membranfilter 27}. MS-forstyrrende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort sentrifugeringstrinn med lav hastighet. Engangsfilterpatronen tilbyr også en utskiftbar SPE-patron, som muliggjør påfølgende prøveopprydding etter resolubilisering og valgfri proteinfordøyelse, i forkant av massespektrometri.

En rekke anbefalte arbeidsflyter for proteomutfelling presenteres her, inkludert modifiserte aceton- og kloroform/metanol/vann^{28-protokoller} , i et konvensjonelt (hetteglassbasert) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraksjonspatron. De resulterende proteingjenvinningene og SDS-uttømmingseffektivitetene fremheves, sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdekning, for å demonstrere det forventede resultatet fra hver protokoll. De praktiske fordelene og ulempene forbundet med hver tilnærming diskuteres.

Protocol

1. Materielle hensyn og prøveforberedelse Bruk bare løsemidler med høy renhet (aceton, kloroform, metanol) (>99,5%) og kjemikalier, fri for overflødig fuktighet. Forbered natriumklorid- og sinksulfatløsninger (1 M) i vann.MERK: Saltløsninger kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur, så lenge de er fri for forurensning eller mikrobiell vekst. Bruk det minste mikrosentrifugehetteglasset av polypropylen (PP) som er tilstrekkelig til å beholde det nødvendige vo…

Representative Results

Figur 4 oppsummerer forventet SDS-deplesjon etter hetteglassbasert eller patron-tilrettelagt utfelling av proteiner i en engangsfilterpatron ved bruk av aceton. Konvensjonell inkubering over natten (-20 °C) i aceton sammenlignes med den raske acetonutfellingsprotokollen ved romtemperatur (trinn 2), samt CMW-utfelling (trinn 4). Resterende SDS ble kvantifisert ved metylenblå virkestoff (MBAS) analyse29. Kort fortalt ble 100 μL-prøve kombinert med 100 μL MBAS-reage…

Discussion

Optimal MS-karakterisering oppnås når gjenværende SDS tømmes under 10 ppm. Mens alternative tilnærminger, som FASP og fordøyelse på perler, tilbyr kvantitativ SDS-uttømming med variabel utvinning 31,32,33, er hovedmålet med nedbør å maksimere renhet og utbytte samtidig. Dette avhenger av å effektivt isolere supernatanten (som inneholder SDS) uten å forstyrre proteinpelleten. Med hetteglassbasert nedbør, når hovedd…

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid