视网膜下植入视网膜色素上皮(RPE)是治疗退行性视网膜疾病的最有希望的方法之一。然而,对大眼动物模型进行临床前研究仍然具有挑战性。本报告介绍了将细胞载体上的RPE移植到小型猪的视网膜下指南。
视网膜退行性疾病(包括年龄相关性黄斑变性)主要起源于视网膜色素上皮(RPE)层或内部,导致视网膜解剖结构进行性紊乱和视觉功能恶化。使用视网膜下细胞载体用体外培养的RPE细胞替换受损的RPE细胞(RPE)已显示出重建视网膜 外 层解剖结构的潜力,因此正在进一步研究。在这里,我们提出了一种手术技术的原理,该技术允许将具有培养RPE的细胞载体有效地移植到小型猪的视网膜下。手术在全身麻醉下进行,包括标准晶状体保留三端口扁平部玻璃体切除术(PPV),视网膜下应用平衡盐溶液(BSS),2.7毫米视网膜切开术,通过额外的3.0毫米硬化切开术将纳米纤维细胞载体植入视网膜下间隙,流体 – 空气交换(FAX),硅油填塞和闭合所有菌核切除术。在过去的8年中,这种手术方法被用于29次手术(18只动物),成功率为93.1%。使用 体内 眼底成像(眼底摄影和光学相干断层扫描)对手术位置进行解剖学验证。在迷你猪眼睛的载体上植入视网膜下RPE的推荐手术步骤可用于未来使用大眼动物模型的临床前研究。
年龄相关性黄斑变性(AMD)被认为是发达国家中心视力丧失的主要原因,也是与视网膜色素上皮(RPE)功能障碍相关的许多疾病之一1,2。RPE位于基底的布鲁赫膜(BM)上,为光感受器提供必要的维护。RPE层的进行性变性是AMD早期萎缩形式的标志,它也伴随着AMD晚期渗出形式的发展。尽管视网膜疾病治疗取得了许多进展,但开发有效的治疗方式仍然具有挑战性3。其中一种有前途的方法是使用体外培养的RPE层进行RPE替代。这种治疗与使用人类胚胎干细胞衍生RPE(hESC-RPE)和诱导多能干细胞衍生RPE(iPSC-RPE)的干细胞研究进展有关3,4,5,6,7。近年来,许多研究小组专注于开发不同的RPE替代方法,使用最初接受的概念验证8,9,10,11,12,13,14,15。RPE细胞(RPE)通常以细胞悬浮液,自支撑细胞片或由人工载体支撑的细胞单层的形式输送到视网膜下空间3,16,17,18,19,20,21。注射细胞悬液是最简单的方法,但BM的受损状况通常会阻止移植细胞的附着。这可能导致RPE的顶基底方向不正确,并且无法形成单层22,23。另外两种方法(即,自支撑细胞片和由人造基质支撑的细胞单层)的主要优点是,当细胞直接植入视网膜下空间24时,细胞已经处于分化的单层状态。
近年来已经发表了许多描述细胞载体输送到视网膜下空间的手术技术8,9,10,11,12,13,14,15。这些研究描述了大眼动物模型的使用,细胞载体的类型,移植细胞培养物的使用,植入器械以及手术技术,作者主要关注视网膜下植入的结果。2015年,Popelka等人报道了使用框架支撑的超薄静电纺聚合物膜将RPE移植到猪尸体眼睛中8。这里描述的细胞载体的视网膜下植入手术技术允许相对精确地处理载体,并且支架易于定位在视网膜下空间。Kozak等人评估了猪眼中尺寸约为2 mm x 5 mm的载体的递送技术的可行性9。细胞载体的独特设计允许其正确放置,防止细胞单层折叠和起皱6。Al-Nawaiseh等人首先提出了兔子视网膜下支架植入的详细分步指南25。Stanzel 等人随后在 2019 年发表了类似的方案,用于小型啮齿动物、兔子、猪和非人灵长类动物的移植26.如前所述,与其他递送技术相比,在固体载体上移植分化和极化的RPE单层可提高移植物的存活率和更好的整合(补充文件1)27。
在体内进行的任何临床前动物研究的目的是揭示手术经玻璃体视网膜下植入细胞载体的各个方面,重点是手术安全性、移植细胞的存活、组织对视网膜下操作的反应以及短期和长期术后结果。据报道,使用猪眼睛作为大眼动物模型在所获得的数据范围方面是相关的,这可能是有用的,并且可能适用于人类10,11,14。我们的研究报告了用于大眼动物模型中细胞载体体内视网膜下植入的手术技术。我们根据过去8年的经验,详细介绍了术前准备,视网膜下细胞载体植入的手术技术以及迷你猪眼睛的术后护理。我们描述了可用于体内实验研究的基本手术原理,涉及植入不同类型的细胞和细胞载体。
大型动物模型
Liběchov迷你猪的实验群是由1967年从美国进口荷美尔菌株的五只动物而建立的。这些动物与其他几个品种或品系杂交用于猪血型研究:地方品种、大白猪、康沃尔猪、越南猪和哥廷根起源的微型猪28,29。在 5 个月大和大约 20 公斤体重 (BW) 时,迷你猪达到性成熟。据报道,亲本迷你猪品种(荷美尔和哥廷根)的存活期为12-20年。细胞载体的视网膜下植入针对视网膜的中央部分。迷你猪的视网膜缺乏黄斑和中央凹。然而,它具有高度浓缩的锥形光感受器区域,称为中央区域和视觉条纹30,31。这些区域负责最高的视力。
手术由四名经验丰富的玻璃体视网膜外科医生在经验丰富的外科设施助理(TA)的协助下进行。在 体内 实验之前,外科医生接受了教育并获得迷你猪眼解剖学的专业知识,例如晶状体与玻璃体体积的比例较低,轴向长度较短(15-19毫米),角膜中没有Bowman膜,玻璃体体积较小(2.8-3.2mL),黄斑和中央凹缺失, 没有Zinn环,以及视盘直径(垂直/水平:1.5毫米/ 2.1毫米)。在所有情况下,手术都是在专门组织的手术室中进行全身麻醉的,并实施标准的无菌和防腐措施。
不同来源的RPE细胞的视网膜下植入是治疗视网膜退行性疾病的眼科研究的一个非常有前途的趋势,例如AMD3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25.该方法的主要思想是用离体培养的健康RPE代替受损的RPE(补充文件1)44,45,46,47,48。使用细胞载体移植培养的RPE细胞是最合理的方法,因为多孔膜将偏振的RPE细胞层保持在相对于光感觉层的正确方向。
最佳动物模型
开发这种治疗方法的关键步骤是使用最佳动物模型49。过去曾使用过小型和大型动物模型,包括兔子、狗、猪和非人灵长类动物8、9、10、11、12、13、14、15、27、29。在本文中,我们提出了使用Liběchov迷你猪模型,并描述了能够实现强大移植效率的术前,手术和术后步骤。Liběchov迷你猪最初是在大约20年前培育的,并经常用于神经退行性疾病领域的生物医学研究,例如帕金森氏症和亨廷顿病29,50。由于猪拥有相对较大的大脑,血液供应和免疫反应与人类相似,因此它也被用作同种异体移植实验的动物模型51,52,53,54。尽管迷你猪的视网膜不具有类似人类的黄斑和中央凹,但它包含中央区域和视觉条纹,它们是视网膜中具有高浓度视锥光感受器的区域30。与人眼相似的大小,富集视锥细胞的中央视网膜的存在,描述良好的免疫系统以及评估术后形态和功能的方法的存在是在所提出的研究中使用这种大型动物模型的重要论据。
手术
据我们所知,没有标准化和广泛接受的手术技术用于载体上RPE细胞的玻璃体视网膜移植。细胞替代疗法的关键问题之一是具有挑战性的手术技术,该技术存在与视网膜脱离、肌张力低下、巩膜、脉络膜和/或视网膜出血以及高眼内湍流相关的术中和术后并发症的风险,这可能导致支架损伤。术后存在增殖性玻璃体视网膜病变、眼内炎、肌张力低下、视网膜脱离和白内障形成的风险4,10,13,14,15。
关于使用细胞载体的方法的首次研究是在龙猫私生兔13,16,25中进行的。尽管这些动物代表小动物模型,但专注于手术技术方面的结果对于大型动物模型中程序的开发至关重要,因此总结如下。
定制的23 G输液插管最初用于两个侧端口,以重定向喷射流,这有助于解决水泡的塌陷和随之而来的视网膜脱离13。在本研究中,我们没有注意到任何这种气泡的坍塌。其可能的原因可能是眼球的尺寸更大,以及核心玻璃体切除术的性能,在套管输注部位的外围保留玻璃体,这可能会降低定向射流的力量。
细胞载体从仪器中弹出过程中的困难是小动物模型中的另一个术中障碍,这些模型被归类为“被仪器困住”。此外,作者认为,视网膜表面残留的玻璃体可能导致植入后载体向后“跳”出视网膜切开口。这个问题可以通过酶辅助玻璃体切除术来解决,该切除术使细胞载体能够平稳、连续地喷射到视网膜下空间。在大多数情况下,作者重新定位载体,以获得远离视网膜切开术的植入物位置。在我们的案例系列中,我们还经历了细胞载体仍然附着在注射器尖端的情况。然而,这是通过缓慢而温和地操纵光导管和注射器尖端来管理的。在我们的任何病例中,我们都没有在视网膜切开术部位观察到任何残留的玻璃体。建议在手术中使用TA辅助PPV作为降低残留玻璃体附着风险的方法。可能需要用 TA 进行多次染色以完全去除上覆的玻璃体。
在另一项研究中,报告了在聚酯膜上以极化细胞单层形式生长的人RPE干细胞的视网膜下植入的结果24。在实验过程中,使用了先前描述的相同手术技术13,但应用了双端口PPV方法。最后,随后发表了兔细胞载体手术视网膜下植入的分步方案25。这项研究对外科手术进行了非常详细且易于重复的描述,包括术前和术后护理,这也是基于以前的经验。
在随后的研究中使用大型动物模型期间,不仅解决了技术问题,还解决了有关移植细胞的免疫反应以及细胞载体大小相关问题的问题。一项使用食蟹猴(Macaca fascicularis)的研究描述了人类干细胞衍生的RPE单层视网膜下植入的结果15。所有动物均接受全身免疫抑制,其包括西罗莫司(负荷剂量为2mg,日剂量为1mg)和四环素(7.5mg / kg-BW ),从手术前7天开始,持续手术后3个月。手术按照前面描述的方案进行24,25。作者使用带有枝形吊灯内照明的25 G三端口PPV方法。重要的是,TA辅助PVD用于排除后视网膜上残留的玻璃体视网膜粘附。作为最初描述的程序的补充,作者使用20 G定制的可扩展环形仪器去除了未来植入区域的宿主RPE层。
在我们的迷你猪研究中,我们还使用了全身免疫抑制。然而,免疫抑制的类型与上述不同。我们以0.25mg / kg BW的剂量皮下注射他克莫司洗脱聚合物微球作为储存库,以阻碍细胞移植排斥反应和炎症反应。我们没有在手术过程中去除宿主RPE细胞层,因为我们的主要目的是分析手术的安全性和植入细胞的活力,而不是它们与宿主视网膜的整合。
此前,在14头雌性尤卡坦迷你猪10中评估了在可折叠的不可降解网状支撑的亚微米Parylene-C膜(6.25 mm x 3.5 mm,0.4 μm厚)上植入单层hESC衍生RPE的安全性和可行性。培养后,将细胞接种到网状支撑的膜上。使用全身施用他克莫司(无方案和剂量)和在手术结束时玻璃体内注射0.7mg地塞米松植入物进行免疫抑制。PPV采用20 G方法进行。作者使用玻璃体内注射曲安奈德乙酮,以更好地观察玻璃体。大硬化切开术的大小为2毫米至3毫米。视网膜下注射后,用临时注射全氟化碳液体使视网膜变平。流体-空气交换后,进行硅油填塞(1,000/5,000 cSt)。术后护理包括在手术后1周眼部应用地塞米松/新霉素/多粘菌素B软膏。作者报告的成功率为91%(即有效的视网膜下植入和足够的术后成像数据)。在我们的研究中,玻璃体内注射TA晶体用于术中,主要用于可视化玻璃体。然而,该药物的局部免疫抑制作用尚不清楚。我们研究中使用的纳米纤维细胞载体为5.2 mm x 2.1 mm和3.7 μm厚,孔径为0.4 μm。在手术过程中,我们进行了直接传真而不是注射全氟化碳液体。我们的手术成功率(93.1%)与Koss等人一致,略好10。
用于视网膜下植入的完全可降解细胞载体(支架)的视网膜下移植于 2019 年在约克郡猪14 中首次研究。该研究主要集中在纤维蛋白水凝胶植入物的可生物降解特性上。作者指出,在家猪上使用的侵袭性免疫抑制可以抑制纤维蛋白水凝胶植入物生物降解过程中可能引起的局部炎症反应。然而,他们没有具体说明猪使用的免疫抑制疗法。在PPV期间,他们进行了3.6毫米长的硬膜切开术,以插入平行于视角膜缘并在其后方约3.5毫米的视网膜下植入装置。此外,他们使用气动驱动的注射系统,旨在减少手指操作引起的手部放置不稳定性。在我们的病例系列中,所有菌核切除术距离角膜缘 2.5 mm 至 3.0 mm。用于插入注射器的大硬化切开术长3毫米。我们研究中使用的植入注射器是手动操作的。彻底烧灼睫状体扁平部和大巩膜切开术内充分切口似乎对于避免术中并发症(如医源性外周视网膜脱离、出血和植入物丢失)至关重要。
总之,我们描述了使用Liběchov迷你猪模型在可生物降解的载体上移植RPE细胞作为遗传性和获得性视网膜疾病的治疗选择。眼睛解剖学和生理学以及免疫系统的相似性使我们能够开发和改进用于视网膜下细胞植入的手术技术和仪器,这些技术和仪器可以很容易地转移到治疗人眼疾病。重要的是要确保在人类手术中使用相同的仪器(包括植入输送工具)对迷你猪进行手术,从而促进将获得的经验和专业知识应用于人类。存在黄斑区域的替代大眼动物模型,例如非人灵长类动物,可用于跟踪和分析视网膜中央区域视网膜下植入后的解剖和功能变化。术前、手术和术后护理程序的详细描述将通过提高高效和标准化的数据生成来对未来的研究有用。
The authors have nothing to disclose.
该项目得到了捷克科学基金会(项目编号18-04393S)和捷克共和国挪威赠款和技术局(KAPPA计划,项目编号TO01000107)的支持。
Technical equipment | |||
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 | Mindray, Shenzhen, China | Wato Ex-65 | anesthesia machine |
R-Evolution CR | Optikon, Rome, Italy | R-Evolution CR | phacoemulsifier/vitrectome |
Green laser Merilas 532α | Meridian, Thun, Switzerland | Merilas 532α | ophthalmic green laser |
Microscope Hi-R NEO 900A | Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) | Hi-R NEO 900A | ophthalmic surgery microscope |
Camera Sony PMW-10MD | Sony, Tokyo, Japan | PMW-10MD | full HD medical 2-piece |
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM | Volk, Mentor, OH, USA | MERLIN BIOM | BIOM |
Steam sterilizer | Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL | 3870 HSG | sterilizer |
iCam100 | Optovue, Fremont, CA, USA | iCAM100 | funduscamera |
iVue OCT100-2 | Optovue, Fremont, CA, USA | iVue OCT100-2 | OCT |
Microsurgical instruments and devices | |||
Cook Eye Speculum | Katena, New Jersey, US | K1-5403 | 15mm blades |
Ophthalmology surgical drape | Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA | 79304 | 132 x 142cm |
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1272.ED06 | |
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula | DORC, Zuidland, Netherlands | 1279.P | |
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up | Surgical Specialties Corporation, Reading, USA | 72-2761G | |
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1270.EXT | |
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe | BBraun, Melsungen, Germany | 4617022V | 3ml |
1ml soft-inject Tuberculin | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 5010.200V0 | 1ml |
8-0 Coated Vicryl | Ethicon, Puerto Rico, USA | J409G | |
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml | (FCI, Paris, France) | S5.7170 | 1000cSt |
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga | Synergetics, O'Fallon, USA | 10.24.23PIN | 23Ga |
Revolution DSP 23Ga ILM forceps | Alcon, Geneva, Switzerland | 706.44 | Griesharber revolution |
23ga Straight Laser Probe | Synergetics, O’Fallon, USA | 55.21.23 | |
FCI Protect 2.0% | FCI Ophthalmics, Paris, France | S5.9100 | viscoelastic |
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 1-501 | Curve |
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-100-1E | 0,3mm straigh |
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-504E | 6mm |
DK Needle Holder, Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 3-201 | 9mm straigh |
Medications and solutions | |||
Unitropic 1% gtt. | UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic | tropicamidum 10 mg/ml | eye drops |
Diprophos | Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands | betamethasonum 7 mg/ml | 1ml |
Alcon BSS Irrigation Solution | Alcon, Geneva, Switzerland | balance salt solution (BSS) | 500ml |
Betaisodona | Mundipharma, Cambridge, United Kingdom | povidon-Iodine 1g/10ml | 30ml |
Depo-medrol 120mg | Pfizer, New Yourk, USA | methylprednisolon | 5ml/200mg |
Shotapen | Virbac Carros Cedex, France | benzylpenicillin, dihydrostreptomycin | 250ml |
Flunixin a.u.v. | Norbrook, Newry, Northern Ireland | flunixinum 50,0 mg | 250ml |
Tramal 100MG/2ML | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadol | 2ml |
Zoletil 100 | Virbac Carros Cedex, France | tiletamine, zolazepam | 100mg |
Narkeran 10 | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | ketamin | 2ml |
Rometar 20mg/ml | Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic | xylazinum | 20mg |
Braunol 75mg/g | B.Braun medical, Prague, Czech republic | povidone iodine | 75mg/g |
Propofol 1% MCT/LCT | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland | propofol | 10mg/1ml |
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid | Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom | isoflurane | 100% |
Benoxi gtt. 4mg/1ml | Unimed pharma, Bratislava, Slovakia | oxybuprakaine | 10ml |
Neosynephrin POS 10% gtt. | Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland | fenylefrin chloride | 10ml |
Ophthalmo-framykoin 1X5GM | Zentiva a.s., Prague, Czech republic | bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate | 5mg |
Floxal ung. | Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany | ofloxacin | 0.30% |
Eficur inj. | Hipra, Amer, Spain | ceftiofurum hydrochloridum | 50mg / 1ml |
Draxxin | Zoetis Inc., New Jersey, USA | tulathromycinum | 100mg / 1ml |
Tramal | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadoli hydrochloridum | 100mg / 2ml |
Xylapan | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | xylazinum | 0.4 mg/kg |
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% | Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA | Proparacaine hydrochlorid | 0.50% |
Prograf | Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA | Tacrolimus powder | 1mg |
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector | |||
Falcon Cell Culture Inserts | Corning Inc., Kenneburg, ME, USA | 353103 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 12604021 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11320033 | |
Biolaminin 521 LN (LN521) | BioLamina, Sundbyberg, Sweden | LN521-02 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 35050061 | |
2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | J66742.0B | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA | P4333 | |
CRALBP | Novus Biologicals, Abingdon, UK | NB100-74392 | |
Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Germany | 21202 |